免疫检查点阻断剂(ICIs)中的anti-PD1抗体能够解除机体对免疫细胞的抑制作用,使免疫细胞重新激活,从而清除肿瘤细胞,抑制肿瘤生长。部分化疗药物能引起肿瘤细胞的免疫原性死亡(ICD),从而增强机体免疫反应过程。平阳霉素(PYM)是我国自行开发和研制的抗肿瘤抗生素,其通过与DNA结合,可引起DNA单链和双链断裂,从而产生抗肿瘤作用。作为肿瘤化疗药物,PYM的突出特点是对骨髓造血损伤轻,无明显的免疫抑制作用。本项研究内容包括:观察PYM在不同肿瘤细胞中的诱导ICD效应,确定PYM能否增强anti-PD1抗体在小鼠模型的抗肿瘤作用,并提高疗效的机制。首先在第一部分实验中,我们通过体外ATP、HMGB1、活性氧检测实验判断平阳PYM能否引起ICD,通过Transwell实验检测THP-1细胞对经过PYM处理过细胞的上清的趋向性。结果显示平阳霉素能够引起ICD,提示平阳霉素有可能用于免疫治疗;平阳霉素能够引起肿瘤细胞释放核酸,增加THP-1细胞的趋向性,提示可能提高抗原提呈作用。为了进一步在实验动物体内评估PYM增强anti-PD1抗体抗肿瘤作用的可行性,我们设计了第二部分实验,利用小鼠肿瘤模型进行评估,并通过流式细胞术分析了PYM和anti-PD1抗体对实验动物外周血和肿瘤组织中免疫相关细胞的影响。结果表明,在乳腺癌4T1肿瘤动物模型实验中,PYM单药组,anti-PD1抗体单药组及联合用药组的肿瘤生长抑制率分别是66.3%,16.1%和77.6%(P<0.05)。PYM与anti-PD1抗体联合组的抑瘤率明显高于anti-PD1抗体单药组。活体成像实验显示,联合用药组的瘤块体积最小,说明PYM和anti-PD1联合能产生更强的抑瘤效果。根据瘤块重量计算的p值,表明PYM和anti-PD1抗体在乳腺癌4T1模型中的联合用药显示出增强效果。通过骨髓切片图像分析,评估PYM和anti-PD1抗体对骨髓的影响,结果显示,联合给药组动物股骨骨髓中的有核细胞密度保持不变。组织病理学观察显示,心、肺、肝、肾、脾等各器官无明显病理改变,表明PYM在可耐受剂量水平增强anti-PD1抗体抗肿瘤作用。通过对外周血单细胞悬液进行流式细胞学分析,结果显示外周血CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞比例没有发生显著变化,联合用药组外周血NK细胞和NK样T细胞相对对照组显著增多;通过对脾脏单细胞悬液进行流式细胞学分析,结果显示脾脏DC细胞比例增加。特别值得注意的是,肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)发生明显变化:联合用药组CD8+TIL细胞比例增加,而CD4+细胞比例减少;PYM单药组可见肿瘤浸润淋巴细胞中的CD8+细胞增加,CD4+细胞减少。此部分研究表明,PYM能够增强anti-PD1抗体在4T1乳腺癌模型中抗肿瘤作用,在B16黑色素瘤模型的结果显示,PYM亦可增强anti-PD1抗体的抗肿瘤作用。本研究首次证明,PYM与anti-PD1抗体联合,可明显提高肿瘤实验治疗效果,提示平阳霉素与免疫治疗药物联合治疗肿瘤的良好临床应用前景。为制备具有被动靶向性的平阳霉素,我们初步进行PYM与人血清白蛋白(HSA)及其纳米颗粒的偶联,并进行偶联比例测定和体内被动靶向性检测,结果表明基于白蛋白分子中反应性巯基进行的位点特异性偶联反应效率低,得到的产物偶联比例低,此方法不适合平阳霉素的偶联。在平阳霉素偶联白蛋白纳米颗粒中,通过增加巯基数目能显著提高平阳霉素偶联效率。活体成像结果显示白蛋白纳米颗粒在荷瘤小鼠肿瘤部位有明显的被动靶向性。