肠道微生物在营养、代谢等方面与宿主密切相关,其对于濒临灭绝的大熊猫(Ailuropoda melanoleura)来说尤为重要。大熊猫拥有一个典型食肉动物的消化系统,其基因组中也缺少编码纤维素酶的基因,仅靠本身无法消化竹子的主要成分纤维素。研究表明,肠道菌群可能在大熊猫利用这些物质中发挥了关键的作用。然而,之前的研究仅仅停留在基于宏基因组学的菌群结构和潜在功能上,对大熊猫肠道菌群的动态发展以及转录活性状态涉及较少。研究大熊猫肠道菌群功能的一个关键阶段是食性转换期。在这个时期(一般为0.5岁至2岁),大熊猫的主要饮食结构由母乳逐渐变化为竹类,对大熊猫适应高纤维食物具有特殊的意义。本研究中,我们利用宏基因组学、宏转录组学以及生物信息学方法对处于食性转换期的6只大熊猫(3只0.5~1岁和3只1.5~2岁,共4个年龄阶段12个样本)的肠道微生物组成结构、功能和变化趋势进行了研究。由于采样的时间点覆盖了夏季和冬季,本研究能够同时分析季节性因素对大熊猫肠道微生物的影响。主要工作和结果如下:1.食性转换期大熊猫肠道菌群的结构和潜在功能通过宏基因组测序,获得了大约4.04亿高品质序列(reads)并拼接得到582,082个片段(contigs);利用不同的生物信息学数据库对微生物的结构(SILVA、MetaPhlAn2、MBGD)和潜在功能(COG-eggNOG、Pfam)进行分析,其中78.5%(457,013)的片段能够至少比对到其中一个数据库中。统计发现食性转换期大熊猫肠道菌群中含量最丰富的细菌为厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)。在4个年龄阶段中,半岁熊猫肠道中(食物为纯母乳)含有最大的微生物种类多样性。随着年龄的增长和食物的改变,这些细菌的丰度发生了巨大的变化,如乳杆菌是0.5岁熊猫肠道中最丰富的细菌,却很难在1岁及以上的熊猫肠道中发现。另外,冬季熊猫肠道中的多样性显著低于夏季,说明季节也是影响大熊猫肠道微生物结构的重要因素之一。在基因水平上,大熊猫肠道菌群中的COG蛋白功能最丰富的类别包括:1)氨基酸转运和代谢,2)碳水化合物转运和代谢,以及3)能源生产和转化,显示了肠道菌群对大熊猫营养供给具有十分重要的作用。这些基因中至少含有55种糖苷水解酶(Glycoside hydrolases gene,GH gene),其中约44%(2,325/5,302)的GH基因拷贝(copies)能够编码靶向植物结构多糖的降解酶。有趣的是,检测到的大多数基因拷贝能够编码低聚糖降解酶(Oligosaccharide-degrading enzymes),而编码纤维素酶(Cellulases)和脱支酶(Debranching enzymes)的拷贝数量较少。在所有细菌中,大肠杆菌(Escherichia coli)和两种梭菌(Clostridium sp.JCC,Clostridium baratii)是含有GH基因最多的菌种。2.食性转换期大熊猫肠道菌群的菌群活性和GH基因表达为更加深入了解食性转换期大熊猫肠道菌群的转录活性,我们利用metaRNA-SEQ方法来研究肠道微生物的所有RNA(包括rRNA、tRNA和mRNA),共获得大约5.27亿条序列。由于目前宏转录组学的生物信息学算法还够不成熟,加上数据中mRNA的含量较少,本研究无法分析大熊猫肠道菌群中全部的转录功能。但由于rRNA常常代表了转录的活跃程度,我们仍然能够探索大熊猫肠道菌群的转录活性并更加专注于GH基因的表达。结果显示,食性转换期大熊猫肠道中大多主要的消化细菌呈现了转录活跃状态(rRNA/rDNA>1),如厚壁菌门和变形菌门的rRNA几乎达到了全部菌群的90%,远远高于它们的rDNA。另外,肠道细菌转录的活跃程度和食物组成也有着重要的联系,如以母乳为主食的0.5岁熊猫肠道中乳杆菌(Lactobacillus)的转录十分活跃,而在之后的年龄组中大多处于抑制状态。其中梭菌属(Clostridium)和埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)在几乎所有的熊猫个体中都出现了转录激活,因此这些细菌是这个时期大熊猫肠道中主要的功能细菌。另外夏季处于转录活跃状态下的细菌数量明显高于冬季,进一步支持了季节性的影响。在基因水平上,高表达的GH基因主要由低聚糖降解酶组成,而大多的纤维素酶和脱支酶很少检测到表达。这些寡糖消化酶的高表达,可能是为了消化由前段肠道微生物降解的纤维素和半纤维素下游产物。另外,GH基因的表达和食物呈现了明显的相关性:0.5岁大熊猫肠道中GH基因的表达量较低,而随着食物中竹子的含量增多这些基因的表达量出现了显著的增长。3.食性转换期大熊猫肠道菌群的变化趋势宏基因组和宏转录组学分析结果显示了食性转换期大熊猫间的个体差异随着年龄的增大而减少,肠道菌群似乎朝着一种特定趋势在发展。因此,本研究进一步利用多种统计方法分析了食性转换期肠道菌群的整体发展趋势和变化原因。首先将每个组的肠道菌群通过丰度大小进行排序,发现在0.5岁大熊猫肠道中,大量中等丰度的细菌占了肠道菌群的大部分比例;而在2岁熊猫中,数量较少的高丰度细菌却占到主要比例。这说明了大熊猫肠道菌群在食性转换期阶段经历了一种压力选择:肠道大多数细菌的丰度减少或消失,变化为少数细菌主导的菌群结构。同样,这种选择压力也存在于基因水平上,但似乎更加偏好GH基因:如在0.5岁大熊猫中检测到总GH基因的88.86%(非GH基因的71.83%),而在2岁大熊猫中仅检测到44.76%(非GH基因的35.40%)。为了更进一步研究GH基因对肠道菌群适应压力的作用,本研究还分别绘制了富含GH基因和不含GH基因的物种累积丰度分布图,发现不含GH物种在食性转换期间损失的丰度远远大于富含GH基因的物种;而相对的是,富含GH基因的物种丰度在各个组间相对稳定(除了0.5岁),主要的富含GH细菌的比例大多保持稳定或随着年龄逐渐增加。由于以上的特点,本研究建立了一个食性转换期大熊猫肠道菌群适应高纤维食物的压力选择变化模型:在食性转换期初期,大熊猫肠道菌群具有更大的个体间差异,因此含有十分多样化的肠道菌群种类;然而随着高纤维食物的压力的选择,大量的非GH微生物丰度变少甚至消失,而数量较少的含有GH基因的细菌逐渐成为优势菌种;在食性转换期末期,大熊猫肠道菌群的个体差异变小,成为由梭菌和大肠杆菌作为主要功能细菌以适应竹饮食的菌群结构。为了验证数据可靠性,本研究还随机选择了26个GH基因进行qPCR或RT-qPCR进行验证。结果显示他们的相对丰度(表达)与测序的结果一致。结论本研究通过多组学测序和生物信息学分析,深入分析了食性转换期大熊猫肠道菌群适应高纤维食物环境的发展变化特点:第一,这一时期大熊猫肠道菌群主要由厚壁菌门和变形菌门组成,乳杆菌(0.5岁时)、梭菌和埃希氏菌是主要的功能细菌。第二,季节是影响大熊猫肠道群落结构的主要因素之一。这可能是由于不同季节竹子和其他食物的营养成分不同导致的,也可能是由于季节影响了大熊猫的采食习惯。第三,大熊猫肠道菌群在食性转换期之间朝着结构更稳定、多样性更低、专一性更强的微生态结构发展。第四,GH基因在大熊猫肠道菌群中广泛存在,这些基因对细菌适应食物中纤维素含量增加起到了重要的作用。综上所述,本研究表明大熊猫和它的肠道菌群似乎在对竹子的消化中产生了一种非常有效的合作机制。