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研究背景:癌症已成为世界范围内的重大公共健康问题,实现癌症的早期诊断和精准治疗对延长患者生存时间有着重要意义。目前在各种诊断方法中,光学成像具有高灵敏度、高空间分辨率和快速采集等优点。近红外二区（NIR-Ⅱ,1000 nm-1700nm）是近年来出现的一种新的光学窗口,相较于近红外一区具有成像分辨率更高、组织穿透深度更深、信噪比更高的特点。研发成像性能佳、靶向性好及生物相容性高的分子影像探针是推进NIR-Ⅱ光学成像领域发展亟需解决的关键问题。吲哚菁绿（ICG）是第一个被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于人体的光学成像探针。ICG在近红外区的发射波长约800 nm,但其荧光发射拖尾能延伸至NIR-Ⅱ窗口,提示ICG具有NIR-Ⅱ区成像的潜力。然而,ICG存在容易自聚集而导致荧光淬灭,半衰期短等缺点,限制了其在NIR-Ⅱ荧光成像的应用。脂质体是一种常见的有机纳米载体,具有毒副作用低,生物相容性好等优点。基于ICG的两亲性,脂质体负载ICG存在两种形式,根据研究策略的不同可将ICG装载至脂质体亲水内核或亲脂的磷脂双分子壳层。本研究将ICG装载在脂质体膜层形成脂质纳米探针LIPO@ICG,通过控制ICG的投入量,避免其产生自聚集效应,实现荧光累积增强的效果。进一步采用细胞膜仿生技术,提取天然的细胞膜并将其修饰在LIPO@ICG表面。根据不同细胞的功能特性,制备出具备病灶部位靶向性、长循环的功能性成像探针。研究内容:研究合成了一系列ICG负载比列不同的LIPO@ICG,筛选出荧光强度相对较高的合成比例;制备癌细胞膜仿生探针,在细胞和动物体内水平进行肿瘤同源靶向功能性分析及材料安全性评估;通过红细胞膜修饰LIPO@ICG,开展血管成像功能性分析;制备中性粒细胞膜仿生纳米脂质探针,探索其在炎症模型中的成像特性等。研究内容及结果主要概括为以下几个部分:第一部分:荧光增强的ICG脂质纳米探针（LIPO@ICG）的制备采用薄膜水化法合成LIPO@ICG,将ICG溶于无水甲醇,与溶于氯仿的脂质材料混合后在氮气环境下吹成薄膜再水化合成脂质体。研究制备出一系列LIPO与ICG摩尔比不同的LIPO@ICG（25:1-1000:1）。应用动态光散射分析不同比例LIPO@ICG的粒径分布;通过近红外二区荧光成像系统观察不同比例LIPO@ICG的NIR-Ⅱ荧光强度,筛选出最优比例的LIPO@ICG,并检测其在不同溶剂条件下60天内荧光强度的变化。实验结果显示,当LIPO:ICG的摩尔比例为25:1-50:1时,LIPO@ICG的粒径约为200 nm,当比例达到100:1-1000:1时,LIPO@ICG粒径约为100 nm。NIR-Ⅱ荧光成像结果表明,LIPO:ICG=250:1为最优合成比例,此时纳米粒载药量可达95%左右,与游离ICG相比,LIPO@ICG的荧光亮度提高了 18.5倍。4℃避光储存60天后,LIPO@ICG的荧光亮度仍保持在62.07%。第二部分:肿瘤细胞膜仿生ICG蛋白脂质纳米探针（TLIPO@ICG）的制备及表征在制备LIPO@ICG的基础上,利用机械挤压的方式将人源胰腺癌细胞SW1990的细胞膜修饰到颗粒表面,制备得癌细胞膜仿生颗粒（TLIPO@ICG）,并对颗粒进行一系列的分析表征。采用透射电子显微镜观察TLIPO@ICG的形态,通过动态光散射分析TLIPO@ICG的粒径大小、电位、多分散系数;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析TLIPO@ICG的蛋白表达;通过圆二色谱分析TLIPO@ICG上蛋白质的二级结构;使用紫外分光光度计和荧光光谱仪分析TLIPO@ICG的紫外吸收光谱和荧光发射光谱特征;根据透析实验检测TLIPO@ICG的药物装载与泄漏情况。实验结果显示,TLIPO@ICG呈球形分布,空载脂质体的粒径为121 nm,LIPO@ICG的粒径为123 nm,TLIPO@ICG的粒径为115 nm,分散性良好。SDS-PAGE和圆二色谱结果显示癌细胞膜蛋白已成功修饰到颗粒表面,且TLIPO@ICG上修饰的癌细胞膜蛋白未发生二级结构改变。紫外吸收光谱结果显示,TLIPO@ICG和LIPO@ICG中ICG光谱发生红移现象,材料裂解后的光谱与游离ICG的光谱重合。荧光发射光谱结果表明,TLIPO@ICG和LIPO@ICG的光谱红移且荧光强度明显升高。相较于游离ICG,TLIPO@ICG在NIR-I区的荧光强度提高了 1.25-1.60倍,在NIR-Ⅱ区提高了 12.80-16.79倍。在不同溶剂中储存了 7天的TLIPO@ICG的粒径大小无明显改变,药物泄露低于10%。第三部分:肿瘤细胞膜仿生蛋白脂质纳米探针（TLIPO@ICG）用于胰腺癌近红外二区成像利用流式细胞仪分析TLIPO@ICG在不同细胞的富集含量变化,采用激光共聚焦显微镜观察SW1990细胞、RAW264.7细胞和原代骨髓巨噬细胞对TLIPO@ICG和LIPO@ICG的摄取差异。构建皮下和原位胰腺癌小鼠模型,检验TLIPO@ICG在近红外一区和近红外二区的同源靶向成像能力;通过红细胞溶血、细胞毒性分析、体内毒副作用评价等初步评估TLIPO@ICG的生物安全性。实验结果显示,胰腺癌SW1990细胞摄取TLIPO@ICG的量最高,其荧光信号是其它七株细胞的1.99-9.27倍。SW1990细胞对TLIPO@ICG的摄取量是LIPO@ICG的1.86倍,表明TLIPO@ICG有较好的同源靶向效果。相反地,RAW264.7巨噬细胞对TLIPO@ICG的摄取量仅为LIPO@ICG的49.8%,在小鼠骨髓巨噬细胞也观察到类似的现象,表明TLIPO@ICG具有一定的免疫生物相容性。TLIPO@ICG在皮下和原位胰腺癌小鼠模型内均具有良好的肿瘤靶向性,经尾静脉注射后12 h肿瘤部位富集量达到最高。NIR-Ⅱ窗口的肿瘤荧光成像效果显著优于NIR-Ⅰ区的成像效果,信噪比显著提高,能够清晰鉴别肿瘤组织的轮廓与边界。溶血性、细胞毒性及体内生化指标结果提示,TLIPO@ICG具有良好的生物安全性。第四部分:红细胞膜仿生蛋白脂质纳米探针（RLIPO@ICG）的制备及用于近红外二区血管成像在制备LIPO@ICG的基础上,利用红细胞膜修饰获得仿生纳米探针一RLIPO@ICG,通过动态光散射检测RLIPO@ICG的粒径分布、电位和多分散系数;应用SDS-PAGE分析RLIPO@ICG的蛋白表达;研究RLIPO@ICG、LIPO@ICG和游离ICG对于小鼠右后肢血管NIR-Ⅱ荧光成像的性能,并采用Image J对成像数据进行半定量分析;根据RLIPO@ICG在血液中的荧光信号评估其体内代谢的半衰期。研究结果显示,RLIPO@ICG的粒径大小约为1 10 nm。SDS-PAGE呈现出RLIPO@ICG与红细胞膜蛋白RCMP的条带相一致。小鼠右后肢血管NIR-Ⅱ荧光成像和ICG血液半衰期计算结果显示,相较于游离的ICG,RLIPO@ICG的体内血液循环时间提高了 13.2倍,表明红细胞膜修饰的纳米颗粒可显著提高纳米探针的半衰期及体内循环时间。第五部分:中性粒细胞膜仿生蛋白脂质纳米探针（NLIPO@ICG）的制备及用于痛风性踝关节炎的近红外二区成像对制备的中性粒细胞膜仿生颗粒NLIPO@ICG,进行了粒径分布、表面电位和蛋白表达等鉴定;构建痛风性踝关节模型,H&E关节组织切片确认模型构建成功。研究显示,NLIPO@ICG粒径约为113 nm,颗粒尺寸相对均匀,NLIPO@ICG与中性粒细胞膜蛋白NCMP的条带相一致,表明中性粒细胞膜修饰的仿生纳米探针已成功制备,可应用于炎症部位的成像分析。研究结论本论文成功制备出NIR-Ⅱ成像信号增强的ICG脂质体,并进一步合成了多种不同类型细胞膜修饰的仿生脂质体。在胰腺癌小鼠模型中探讨了癌细胞膜仿生探针的肿瘤同源靶向性,通过对比近红外一区和二区的成像效果,证实了TLIPO@ICG可用于肿瘤近红外二区荧光成像;研究所构建的红细胞膜修饰的仿生ICG成像探针具有长循环特性,可显著提高体内循环时间,并具备良好的生物安全性;所制备的中性粒细胞膜仿生颗粒NLIPO@ICG显示出靶向炎症部位的潜能。