论文部分内容阅读
自发现青霉素以来,抗生素在多种常见细菌感染性疾病的治疗中发挥了重要的作用。然而因抗生素滥用导致耐药菌株产生、食品的抗生素残留、住院病人肠道菌群紊乱、水源和土壤的抗生素污染等一系列问题,如今抗生素的负面作用已引起全球的广泛关注。寻找绿色安全、高效无毒的抗生素替代品迫在眉睫。大量研究表明,益生菌在促进动物生长、增强机体免疫力、抗细菌感染、调节肠道微生态平衡等方面发挥重要作用,是一种理想的抗生素替代品。本研究拟从偏远山区农户未饲用混合饲料且生产性能优良的经产母猪粪便中,筛选对低p H值和高胆盐有较好耐受性,且同时产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的芽孢杆菌菌株;筛选耐酸和胆盐且能同时抑制Eerichia coli O157:H7、Sphylococcus typhimurium和Slmonella sonnei三种常见肠道致病菌的乳酸杆菌菌株。通过添加到雏鸡日粮中,研究其对鸡生长和免疫性能的影响,为高效饲用益生菌制剂产品的开发和应用打下基础。研究结果如下:1.挑选重庆山区从未添食配合饲料且生产性能优良的经产母猪,采集其新鲜粪便,样品经80℃水浴15 min后在LB培养基上分离细菌,分离株再经pH3.0 2 h、0.5%胆盐24 h处理,挑选存活率均高于90%的菌株。用透明圈法检测其产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的能力,利用API生化反应及16S rDNA片段核苷酸序列进行细菌鉴定。结果显示,共分离到7株菌能同时产生这三种酶,分别命名为P1.1-4、P1.1-10、P1.2-1、P1.2-3、P1.3-1、P1.3-5、P1.4-2。其中,P1.1-4产淀粉酶能力最强,D/d值为2.03,P1.1-10、P1.3-1具有高产蛋白酶能力,D/d值分别为7.90和6.56,7株菌产纤维素酶能力差异不大,D/d值均在1.5左右。经生化鉴定与16S rDNA分子鉴定这7株菌为嗜热脂肪芽孢杆菌(P1.2-1),地衣芽孢杆菌(P1.3-5)和枯草芽孢杆菌(P1.1-4、P1.1-10、P1.2-3、P1.3-1、P1.4-2)。2.从上述新鲜粪便中分离到6株耐酸、耐胆盐的乳酸杆菌,经生化鉴定与16S rDNA分子鉴定为德氏乳酸杆菌(P3-a),植物乳酸杆菌(P3-b),嗜酸乳酸杆菌(P1.1-a、P1.1-c、P4-a、P5-a)。测定各菌株对10种常用抗生素的敏感性,结果表明,所有菌株对环丙沙星和庆大霉素耐药,对氯霉素敏感,对克林霉素、甲硝唑、苄星青霉素、万古霉素有不同程度的敏感性;P3-b、P5-a对磺胺没有明确的耐药、敏感折点,其余4株乳酸杆菌对磺胺耐药;P1.1-a、P1.1-c对5种抗生素耐药。平板试验表明这6株乳酸杆菌的培养液对E.coli O157:H7、S.typhimurium和S.sonnei均有抑制作用,其中,植物乳酸杆菌P3-b对三种致病菌的抑制作用最强,抑菌圈分别为16.2 mm、15.3 mm和17.8 mm。在MRS中培养24 h后,P1.1-c、P3-a的pH值下降至4.2左右,P1.1-a、P3-b、P4-a、P5-a下降至3.5。将三种致病菌分别接种于用乳酸杆菌P3-b培养液调制的MRS液体培养基中,其生长曲线均表现为pH值越低生长越缓慢。小鼠试验表明,植物乳酸杆菌P3-b能减轻小鼠感染Citrobacter rodentium所致的体重下降。3.选用产淀粉酶较强的P1.1-4、产蛋白酶较强P1.3-1和抑菌效果最好的乳酸杆菌P3-b来研究猪源益生菌对雏鸡抗沙门氏菌感染的作用。将108 CFU/mL的芽孢杆菌和/或108 CFU/mL的乳酸杆菌拌料饲喂20日龄的海兰灰鸡,一周后感染沙门氏菌(1×1010 CFU/只),并持续添食益生菌三周。感染后每天检测粪便中的沙门氏菌的数量;每周称空腹体重并记录采食量,计算料重比;将鸡处死后后取肌胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、胰腺、脾脏及法氏囊进行组织学分析。结果显示,感染后1天,各组粪便中检测到的沙门氏菌含量差异不大,沙门菌106 CFU/g左右,之后各组致病菌含量随感染时间的延长呈下降趋势。其中安慰组和芽孢杆菌组下降最快,且在感染6天后粪便中检测不到沙门菌;感染对照组下降最慢,在感染12天后粪便中检测不到沙门菌。芽孢杆菌组的平均日增重为7.36 g,料重比为9.6,显著优于感染对照组(P<0.05),乳酸杆菌组和混合菌液组略好于感染对照组。添食益生菌后鸡小肠的肌层厚度无明显变化,单一或复合添食乳酸杆菌和芽孢杆菌能提高鸡大肠段的肌层厚度。单一添食乳酸杆菌对肠道绒毛长度无显著影响,添食芽孢杆菌或混合菌能明显增加肠道的绒毛长度。添食芽孢杆菌的鸡脾脏和法氏囊明显增大,免疫器官指数显著高于感染对照组(P<0.05),组织学观察显示法氏囊内淋巴细胞大量增生,仅添食乳酸杆菌的鸡法氏囊未见明显变化。鸡肠道主要病变为肠粘膜分叶核白细胞浸润和毛细血管扩张充血或出血。添食芽孢杆菌组和添食混合菌组的肠道粘膜毛细血管的扩张充血和出血较感染对照组轻微,其中混合菌组与感染对照组有显著性差异(P<0.05);肠道分叶核白细胞浸润程度没有显著性差异。综上所述,本研究从健康猪粪便中筛选出7株产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的芽孢杆菌和6株乳酸杆菌。对雏鸡添食4周芽孢杆菌和乳酸杆菌能增加肠道肌层厚度和绒毛长度,降低料重比,增强鸡抗沙门氏杆菌感染的能力。