论文部分内容阅读
视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa,RP）,是一组以光感受器进行性凋亡为特征的、不可逆的、严重的致盲性眼病。迄今为止,已发现逾200种突变基因与RP的发生相关,其发病率越为1:4000。RP变性过程中的视网膜重塑可以分为三个阶段:早期为光感受器细胞应激反应期;变性中期以光感受器细胞凋亡,下级神经元重塑伴随胶质细胞活化、胶质化为主要特征;晚期为光感受器细胞基本消失、视网膜内层神经元重塑、胶质细胞形成胶质瘢痕。Müller细胞是视网膜内横跨视网膜各层,并与各级神经元保持功能紧密联系的最重要的胶质细胞。视网膜变性过程中Müller细胞重塑形成的胶质瘢痕,因其能够分割残留视网膜神经元与视网膜色素上皮、脉络膜之间的交流,所以会加剧视网膜神经元的变性,并成为干细胞移植、基因治疗、视觉假体移植等方式治疗视网膜变性疾病的严重阻碍。阐明视网膜变性过程中Müller细胞重塑的机制成为亟待解决的科学问题。Müller细胞胶质化的主要特征是其胶质激活即胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）表达升高。启动Müller细胞的活化和胶质化的始动因素目前尚不清楚。如何降低Müller细胞胶质化、减少视网膜神经元的凋亡进而延缓视网膜变性的进程一直是研究的热点与难点。谷氨酸是光感受器释放的唯一的神经递质,也是唯一贯穿视网膜全层的神经递质。暗环境下光感受器细胞持续释放谷氨酸,释放到突触间隙的谷氨酸被位于下级神经元上的谷氨酸受体感受而进行信息传递,同时释放到突触间隙的谷氨酸必须被迅速的清除,以使得谷氨酸浓度在突触前和突触后维持在一定的浓度梯度,这样才能保持突触传递较高的信息传递信噪比并避免兴奋性氨基酸堆积引起的兴奋性毒性导致神经元凋亡。Müller细胞可通过其膜上谷氨酸/天冬氨酸转运体（glutamate/asparate transporter,GLAST）将谷氨酸转运进入胞内,通过谷氨酰氨合成酶（glutamate synthetase,GS）将其转化为谷氨酰胺,再通过谷氨酰胺转运体（SN1/2）运送到胞外,进而为神经元吸收并利用,此过程被称为谷氨酸-谷氨酰胺循环（glu-gln cycle）。既往研究指出正常视网膜中,光感受器细胞-双极细胞形成的突触间的谷氨酸主要是通过位于突触前膜上的谷氨酸转运体来完成清除,而Müller细胞主要负责视网膜内层谷氨酸的代谢。是当选择性的失活Müller细胞后,视网膜光感受器功能则明显受损。同时,在视网膜变性早期,Müller细胞的谷氨酸代谢即出现异常,位于双极细胞上的代谢型谷氨酸受体6（metabotropic glutamate receptor 6,mGluR6）最早出现明显改变。因此,我们提出假设:视网膜变性过程中,谷氨酸及其代谢型受体功能的异常是触发Müller细胞重塑的始动因素。针对以上假设,本文的研究内容和结果如下:一、Müller细胞调控mGluR5影响闪光视网膜电图（flash electroretinogram,FERG）的a波幅值。正常大鼠视网膜下腔注射GS的抑制剂,DL-AAA或者MSO,发现其能够降低反映视网膜光感受器功能的FERG的a波幅值;同时,通过免疫组化、免疫印迹（Western Blotting,WB）和定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time,PCR）发现抑制GS后视网膜mGlu R5会被激活;通过视网膜下腔注射mGluR5的激动剂（CHPG）和抑制剂（MPEP）,证实mGluR5的活性改变可调控FERG的a波幅值,同时抑制GS后可上调反映光感受器细胞功能的标记物rhodopsin;接着,通过膜片钳技术发现mGluR5的激活可通过调控Müller细胞的内向整流钾离子通道（inwardly rectifying potassium channel,Kir）电流幅值而发挥作用,通过PCR和WB发现mGlu R5能够调控Müller细胞的Kir4.1和水通道蛋白-4（aquaporin-4,AQP4）的表达,通过免疫共沉淀发现mGlu R5与Kir4.1和AQP4形成大分子复合物;最后使用钙离子成像技术和WB证实mGluR5对Müller细胞调控作用的内部信号通路为G?q-Ca2+通路。二.Müller细胞通过mGluR8调控大鼠视网膜FERG的振荡电位（oscillatory potentials,OPs）幅值。在正常大鼠视网膜下腔注射GS的抑制剂后发现,视网膜内层神经元的功能降低,主要表现为FERG的b波幅值和OPs波幅值的降低;通过离体和在体免疫组化,发现并证实了mGluR8在Müller细胞上表达。通过免疫组化和PCR,发现抑制GS后mGluR8被激活;通过视网膜下腔注射mGlu R8的抑制剂（MSOP）,发现MSOP能够挽救由GS抑制引起的FERG幅值的降低。通过视网膜下腔注射mGlu R8的激动剂（DCPG）发现其FERG的b波、OPs波幅值明显降低;通过免疫组化和PCR证实DCPG注射后Müller细胞的GS表达水平降低但GFAP表达水平明显升高;通过玻璃体腔注射不同神经元及受体的激动剂和抑制剂阐明了大鼠暗适应OPs的生理起源为GABA能受体对ON型双极细胞形成的反馈回路,最后通过免疫组化证实了mGluR8影响内层神经元功能主要是通过Müller细胞介导GABA递质的释放调控GABAa受体的表达所致。三、视网膜色素变性大鼠（RCS大鼠）变性过程中谷氨酸及其代谢型受体mGluR5/8的的变化。通过FERG的a波幅值呈指数函数降低证实了视网膜变性早期光感受器即开始变性;通过免疫组化和PCR发现在RCS鼠P20d时Müller细胞的GS形态即改变,在整个变性过程中其表达呈先降低再升高后降低的趋势;通过高效液相色谱法发现RCS鼠变性过程中谷氨酸含量的变化呈先降低再升高后降低的趋势;通过免疫组化、WB和PCR发现RCS鼠变性中后期mGlu R5和mGluR8被过度激活。基于以上发现,本文提出了以Müller细胞变化为特征的视网膜变性“三阶段进程”:早期,Müller细胞GS表达逐渐降低,mGluR5和mGluR8逐渐降低;中期,Müller细胞GS表达逐渐升高,mGlu R5和mGluR8表达逐渐升高;晚期,Müller细胞GS表达降低,mGlu R5和mGlu R8表达异常升高。四、调控mGluR5和mGlu R8后堆RCS鼠视网膜功能和形态学的影响。通过视网膜下腔注射mGlu R5的抑制剂（MPEP）到P40d的RCS鼠中,发现其FERG的幅值在注射后2、4天后明显升高且该趋势一直保持到注射后28天;通过免疫组化和PCR发现MPEP注射后4天,Müller细胞GFAP表达明显降低,但GS、Kir4.1和AQP4表达明显升高,同时光感受器细胞的标记物rhodopsin表达明显升高;通过视网膜下腔注射mGluR8的抑制剂（MSOP）到P40d的RCS鼠中,发现其FERG的幅值,尤其是OPs的幅值明显升高;通过免疫组化和PCR发现MSOP注射后Müller细胞GFAP表达明显降低,但GS、Kir4.1和AQP4表达明显升高,同时光感受器细胞的标记物rhodopsin表达明显升高。因此,我们得出以下结论:通过mGlu R5/Kir4.1/AQP4大分子复合物,Müller细胞可以调控视网膜光感受器功能;通过mGluR8介导GABA受体活性,Müller细胞可以调控视网膜内层神经元功能;谷氨酸及其代谢型受体功能异常是启动RCS鼠变性过程中Müller细胞活化和胶质化的始动因素;mGluR5和mGluR8可以成为改善RCS鼠视觉功能的潜在治疗靶点。