论文部分内容阅读
背景与目的:肺癌是全球癌症死亡率和发病率最高的恶性肿瘤,每年有近160万人死于肺癌。其中非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）约占所有肺癌的85%,肺腺癌是NSCLC最常见的病理组织学类型。Esrrb是雌激素相关受体家族中的一员,广泛参与了机体的生长发育以及维持胚胎干细胞多能性及自我更新。有研究表明,Esrrb与乳腺癌、前列腺癌、肝癌、食管癌、脑胶质母细胞瘤等多种肿瘤的发生发展密切相关。但Esrrb在肺癌中的表达情况及其发挥的作用目前却尚不清楚。因此,本研究的主要目的旨在明确Esrrb在肺腺癌中的表达情况及其临床意义,并试图探讨Esrrb在调控肺腺癌恶性生物学行为的潜在分子机制,以期为肺癌的靶向治疗提供实验依据。方法:在GEO数据库中分析了Esrrb的表达情况与肺癌患者及肺腺癌患者之间的预后关系。采用慢病毒感染A549肺腺癌细胞株,通过qRT-PCR和Western blot验证敲低及过表达效率,成功建立Esrrb敲低和过表达细胞模型。进一步通过qRT-PCR和Western blot探讨敲低和过表达Esrrb后对OCT4、Nanog、SOX2干性相关因子的影响,并采用细胞成球实验、克隆形成实验和CCK8增殖实验了解Esrrb对A549自我更新和增殖的影响。机制上,用ALDH检测试剂盒分选出ALDH（+）的A549细胞,通过qRT-PCR和Western blot分别检测Esrrb及β-catenin的表达情况。采用Co-IP和免疫荧光共定位实验验证了Esrrb与β-catenin相互作用。并通过影响Wnt/β-catenin信号通路的状态来验证Esrrb的表达是否受到影响。最后我们收集了163例肺腺癌患者标本进行了Esrrb和β-catenin的免疫组化染色,Kaplan–Meier生存曲线分析它们的表达与患者预后的关系。结果:1.GEO数据库分析发现高表达Esrrb的肺癌患者预后不良,并且在肺腺癌患者中表现出更明显不良预后。2.慢病毒感染A549细胞后,qRT-PCR和Western blot显示敲低Esrrb后Esrrb表达降低,而过表达Esrrb后Esrrb表达上调,成功建立Esrrb敲低和过表达细胞模型。3.qRT-PCR和Western blot显示敲低Esrrb后OCT4、Nanog、SOX2干性相关因子有所下调,类似的,过表达Esrrb后,OCT4、Nanog、SOX2干性相关因子的表达均有所上升。4.成球试验显示:过表达Esrrb后A549细胞的成球能力增强,形成的细胞球体积增大,数目增多;敲低Esrrb后,细胞所成球体积减小,数目减少。5.克隆形成和CCK-8实验提示:敲低Esrrb后A549细胞形成的克隆数目减少,体积变小,细胞克隆能力明显下调,CCK8生长曲线提示生长速度变慢,细胞增殖能力减弱;而过表达Esrrb后,细胞所成克隆数增多,体积增大,CCK8生长曲线提示生长速度加快。6.qRT-PCR和Western blot显示:ALDH（+）的A549细胞Esrrb和β-catenin的表达明显高于ALDH（-）A549细胞。7.Co-IP实验显示在A549细胞中Esrrb与β-catenin形成复合物相互作用,免疫荧光实验提示Esrrb与β-catenin在细胞核共定位。8.通过影响Wnt信号通路活性提示,Esrrb的表达随着Wnt信号通路上β-catenin的表达而变化;激活Wnt信号通路,Esrrb的表达随着β-catenin的升高而升高,抑制Wnt信号通路,Esrrb的表达随着β-catenin的降低而降低。9.收集163例肺腺癌患者标本进行Esrrb和β-catenin免疫组化染色,Kaplan–Meier生存曲线分析提示:Esrrbhigh的患者生存时间明显少于Esrrblow的患者。Esrrbhighβ-cateninhigh的病人其预后最差。结论:1.Esrrb可促进肿瘤细胞的自我更新和增殖。2.Esrrb在肺腺癌中,尤其在肺腺癌干细胞中高表达。3.Esrrb与β-catenin相互作用,可能通过Wnt/β-catenin信号通路影响肺癌恶性表型。4.在肺癌患者中Esrrb高表达提示预后不良。