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目的以ATRA诱导的方式建立人急性早幼粒白血病细胞株HL60向粒系分化的模型,采用优化的双向电泳方法对分化前后的细胞全蛋白进行分离,对差异表达蛋白进行质谱鉴定和数据库搜索,为HL60细胞向粒系分化时的蛋白分子机制研究提供新的实验依据。方法1.采用全反式维甲酸对HL60细胞进行诱导分化。通过MTT、流式细胞技术分析细胞增殖情况和CD11b细胞表面分化抗原的表达,选择最适的药物浓度和诱导时间;再通过细胞化学染色、细胞透射电镜观察、细胞周期和凋亡检测对分化结果进行验证,构建分化模型。2.对影响双向电泳分离效果的关键条件进行改进。主要通过对比不同的蛋白提取方法;对比传统等点聚焦条件50 V 5 h,100 V 2 h,500 V 2 h,1000 V 2 h, 1000～8500 V线性升压4 h,8500 V 70000 Vh和改良等点聚焦条件450V 2h,4380V 2h,4380V 1h33min所得的双向电泳结果的蛋白分离情况和重复性,选取最适的蛋白提取方法和改良等点聚焦条件。3.采用改良双向电泳分离技术对细胞全蛋白进行分离,运用PDQuest软件分析HL60细胞分化前后蛋白表达差异,并用基质辅助激光解吸-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对差异蛋白点进行鉴定。4.经MALDI-TOF-MS分析,得到肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF),使用Mascot软件在Swissprot数据库中检索鉴定差异表达蛋白质,并进行生物信息学分析。结果1. ATRA明显抑制HL60细胞增殖,并随药物浓度的增加,抑制效果也越显著;2μM的ATRA连续作用HL60细胞5天即有90%以上的细胞有粒系分化标志抗原CD11b的表达。细胞化学染色和透射电镜结果亦表明诱导后的HL60细胞向粒系分化。细胞周期阻滞于G0～G1期,没有出现明显的细胞凋亡现象。2.采用标准蛋白提取方法和改良后双向电泳条件,所得蛋白点数为1102±7.40,重复性为74.82±6.44%。3.将分化前后的HL60细胞全蛋白经过改良双向电泳技术分离,PDQuest软件比对,MAIDI-TOF分析,发现有25个蛋白点仅在未分化组的凝胶谱中找到,有15个蛋白点仅在分化组的细胞蛋白表达谱中找到。其中有的是癌基因表达蛋白,有的是抑癌基因表达蛋白,还有的则参与凋亡过程等。结论建立了ATRA诱导HL60细胞向粒系分化的完整模型。改良的双向电泳技术明显提高了药物作用前后细胞总蛋白的分离效果,其重复性良好。所发现的一批与ATRA诱导HL60细胞向粒系分化过程有关的上调与下调蛋白有助于了解分化的分子机制。