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家蝇Musca domestica的整个生活史都与复杂的微生物环境有着紧密联系,其高效的先天免疫防御机制能够保护家蝇不受病原菌的侵害。但同时,微生物又在家蝇幼虫发育中起着至关重要的作用,不恰当的免疫应激可能对无害的共生菌群造成破坏,或对机体造成损伤。因此家蝇需要严格控制免疫系统的强度,在维持共生菌与应对病原体感染之间取得平衡。作为一种模式识别受体,肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)在免疫系统应对细菌感染过程中起着重要的调控作用。本实验室前期在家蝇中克隆得到一种肽聚糖识别蛋白PGRP-SC,该蛋白在家蝇幼虫肠道中表达量最高,我们猜测家蝇PGRP-SC可能在肠道免疫中起调控作用。为验证这一假设,我们通过RNAi技术干扰家蝇幼虫PGRP-SC基因表达,进而对该肽聚糖识别蛋白在家蝇幼虫肠道免疫中的功能进行鉴定。主要研究内容如下:(1)我们使用注射法和投喂法两种方式尝试对家蝇幼虫PGRP-SC基因进行RNA干扰:首先通过体外合成双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)并注射到家蝇1龄幼虫体内,利用qPCR技术检测PGRP-SC基因的表达情况。结果显示,与阴性对照组相比,在注射48 h后干扰组幼虫目的基因表达量出现极显著下调,最大干扰效率为70.94%。接下来,我们对家蝇1龄幼虫投喂表达dsRNA的大肠杆菌,并利用qPCR检测PGRP-SC基因表达情况。结果显示,与阴性对照组相比,在注射24 h后干扰组幼虫目的基因表达量出现显著下调,在注射48 h后干扰组幼虫目的基因表达量出现极显著下调,最大干扰效率为53.95%。(2)通过投喂表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的大肠杆菌可以在荧光显微镜下监测摄入的外源细菌在家蝇幼虫肠道内的时空动态。分别对阴性对照组和干扰组完成投喂后,放置30 min再次在荧光显微镜下观察,发现干扰组幼虫肠道内荧光明显减弱,说明摄入的大肠杆菌被幼虫清除。(3)分别对空白对照组、阴性对照组以及干扰组幼虫肠道内过氧化氢含量进行检测,发现各组数据之间没有显著性差异,推测在上述清除过程中不涉及过氧化氢合成的参与。(4)利用荧光定量PCR技术,分别对阴性对照组和干扰组幼虫肠道内attacin,diptericin,muscin和cecropin等抗菌肽基因的表达情况进行了检测,并发现干扰PGRP-SC表达之后,4种抗菌肽基因表达均有不同程度的显著上调,表明PGRP-SC在控制家蝇幼虫肠道免疫敏感程度中起作用。干扰PGRP-SC基因表达可能引起IMD通路激活并导致下游抗菌肽的合成,从而对摄入肠道内的外源大肠杆菌进行清除。