论文部分内容阅读
手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病。近几年来,手足口病在亚太地区呈上升趋势,成为危害婴幼儿健康的重要传染病。肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)是HFMD最重要的病原体,柯萨奇A16型(Coxsackies A16, CA16)也在HFMD中占有一定的比例,目前EV71和CA16是我国近几年流行的两种重要病原体。由EV71感染引起的手足口病临床表现为手足口部位出现皮疹或疱疹、溃疡等,在婴幼儿常会伴有严重的神经性并发症,包括病毒性脑膜炎、脑炎以及脊髓灰质炎样麻痹,引起的肺水肿、肺出血常导致婴幼儿死亡。迄今为止尚无特效抗病毒药物问世,疫苗将成为预防控制手足口病流行最有效的手段之一。疫苗的研制包括减毒活疫苗、灭活疫苗及基因工程疫苗,这些疫苗各有特点,本文重点研究了杆状病毒作为表达系统表达EV71主要抗原基因形成类病毒颗粒及其免疫效果。在新型疫苗中,亚单位疫苗以类病毒颗粒(Virus-like Particles, VLPs)较为理想,因其由病毒外壳蛋白所组成,构象上最接近天然病毒颗粒,具有较好的免疫原性,且不含病毒基因组成分,安全性较高,这些优点使类病毒颗粒疫苗成为基因工程疫苗研究的热点。杆状病毒表达系统(baculovirus expression system, BES)是一个以昆虫杆状病毒为外源基因载体,以昆虫细胞为受体的真核表达体系。因其可以容纳大片段外源基因进行表达,使其在疫苗研究中更具有优势,也由于是在真核系统中表达,杆状病毒表达系统被认为是表达类病毒颗粒的最佳表达系统之一目的：利用流行地区分离到的EV71毒株,应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达EV71类病毒颗粒,并对类病毒颗粒的免疫原性做了初步评价。方法：首先对科室构建保存的携带EV71结构蛋白基因P1与非结构蛋白基因3CD的供体质粒pFastBac-Dual-Pl-3CD进行双酶切鉴定,然后将鉴定正确的供体质粒转入E. coli DH10中,与杆状病毒质粒Bacmid进行同源重组,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,构建重组杆状病毒质粒Bacmid-Pl-3CD,将重组杆粒通过脂质体转染法转染昆虫细胞sf9细胞系,获得携带EV71病毒结构基因P1和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒rBV-Pl-3CD,并通过蚀斑的方法对重组杆状病毒的滴度进行了测定。采用免疫荧光、Western Blot及电镜观察等方法检测重组病毒表达产物特异性及形态学特征。表达产物经蔗糖密度梯度离心纯化,纯化后的目的蛋白经电镜、Western Blot鉴定后免疫BALB/c小鼠,用ELISA、微量中和试验的方法对其免疫效果进行初步评价。结果：PCR鉴定结果显示构建的重组杆状病毒rBV-Pl-3CD中可扩增到特异性的P1和3CD基因,间接免疫荧光表明重组杆状病毒rBV-Pl-3CD能特异性表达EV71结构蛋白,Western Blot结果可见分子量约为39KD,条带符合VPl分子量,证明P1基因可被表达的3CD酶正确切割。电镜结果可观察到大小约为24nm-30nm的颗粒,ELISA法检测到实验组小鼠血清中抗EV71特异性IgG抗体,效价为1：776,微量中和实验显示,血清能中和EV71病毒,中和效价为1：588。结论：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统共表达EV71的结构蛋白P1和非结构蛋白3CD,经3CD正确切割P1,在sf9细胞中组装形成EV71类病毒颗粒。经动物实验初步评价,该类病毒颗粒能够诱导实验小鼠产生特异性抗EV71抗体,具有较好的免疫原性。这项研究获得的结果为EV71新型疫苗的研发提供了依据和参考。