二硫键是蛋白质链内或链间两个Cys之间的共价连接，二硫键的形成是氧化型蛋白质折叠和成熟过程中的重要步骤，它可以提高蛋白质的稳定性，避免蛋白质变性，降低蛋白水解酶对蛋白质的降解作用，为蛋白质形成正确的结构和行使正确的功能所必需。大肠杆菌中催化二硫键的系统现在已经研究的比较透彻，该系统主要通过DsbA蛋白和DsbB蛋白实现电子的传递过程。近年来，在微生物中发现了一条新的催化二硫键形成的途径（维生素K环氧化物还原酶途径，VKOR途径），其中VKOR蛋白是这条途径中催化二硫键形成的关键组分。高等植物中普遍存在编码VKOR同源蛋白的基因，但是该基因编码的蛋白其功能如何还几乎一无所知，为此，我们选取拟南芥VKOR作为研究对象，对高等植物VKOR催化二硫键形成功能进行了初步研究，并利用定点突变技术确定了植物VKOR催化二硫键形成所必需的半胱氨酸，主要结果如下：　　 （1）拟南芥VKOR信号肽预测及结构分析。利用TargetP、PredSL和ChloroP在线程序预测该基因编码蛋白的信号肽为N-末端45个氨基酸。将拟南芥VKOR蛋白与已发现的催化二硫键形成的蛋白进行二级结构及拓扑结构比对，结果表明，拟南芥VKOR蛋白为一融合蛋白，有两个结构域即膜蛋白结构域和水溶性结构域组成，N-末端跨膜区与人类维生素K环氧化物还原酶（VKOR）同源，C-末端亲水区与大肠杆菌DsbA蛋白同源。我们将拟南芥VKOR全长命名为AtVKOR-DsbA，N-末端跨膜区命名为AtVKOR（45-214），C-末端亲水区命名为AtDsbA（204-376）。　　 （2）AtVKOR-DsbA、AtVKOR-DsbA不带信号肽、AtVKOR结构域、AtDsbA结构域的克隆。从NCBI上查出拟南芥AtVKOR的基因序列，并依据该序列设计引物，以拟南芥的总cDNA为模板，分别扩增带信号肽AtVKOR-DsbA、去除信号肽AtVKOR-DsbA以及 AtVKOR（45-214位氨基酸）、AtDsbA（204-376位氨基酸）基因片段，并将基因片段分别连在表达载体pTrc99a，分别构建原核表达载体pTrc99a-TP-AtVKOR-DsbA（全长）、pTrc99a-AtVKOR-DsbA（不含信号肽全长），pTrc99a-AtVKOR和pTrc99a-AtDsbA。　　 （3）用细胞运动性检测拟南芥VKOR催化二硫键形成的功能。大肠杆菌缺失DsbA或DsbB会丧失催化二硫键形成能力，不能为鞭毛蛋白FlgI引入对其功能必须的二硫键，造成细胞丧失运动性。我们上述表达载体分别转化二硫键形成缺陷型大肠杆菌细胞，检测了AtVKOR-DsbA及各结构域催化二硫键形成的能力。实验结果表明：缺失信号肽的AtVKOR-DsbA能够恢复二硫键形成缺陷型大肠杆菌的二硫键形成能力，形成有功能的鞭毛蛋白，使大肠杆菌细胞恢复运动性。说明AtVKOR-DsbA具有二硫键形成功能。但是带有信号肽的VKOR全长、AtVKOR、AtDsbA都不能单独恢复二硫键形成缺陷型菌株的二硫键形成功能。　　 （4）用半乳糖苷酶活性检测拟南芥VKOR催化二硫键形成的功能。选用的受体大肠杆菌细胞其基因组整合了膜蛋白MalF与β-半乳糖苷酶的融合基因，膜蛋白MalF将β-半乳糖苷酶的N-末端固定于细胞膜上，当β-半乳糖苷酶形成二硫键时则失去活性。实验结果表明，当去除信号肽的AtVKOR-DsbA全长蛋白表达时，β-半乳糖苷酶以无活性形式存在，说明有二硫键的形成，而分别表达带信号肽的全长、AtVKOR或AtDsbA时，β-半乳糖苷酶以还原态存在时，能够分解X-gal生成深蓝色物质，说明带信号肽的全长、AtVKOR或AtDsbA不能催化二硫键的形成，该结果与细胞运动性实验结果吻合。　　 （5）用基因定位突变技术确定必需半胱氨酸残基。我们利用Quickchange定点突变技术，在基因水平上分别将AtVKOR-DsbA的十个半胱氨酸突变为丙氨酸，并且将同一跨膜区的一对半胱氨酸双突变为丙氨酸，研究半胱氨酸对AtVKOR-DsbA功能的影响，实验结果表明：硫氧还蛋白典型原件C-X-X-C结构中的半胱氨酸（Cys195-Cys198，Cys293-Cys296）以及相距较远的两对保守半胱氨酸（Cys109-Cys116，Cys316-Cys331）对于AtVKOR-DsbA的二硫键形成功能是必需的。另外两个位点的非保守半胱氨酸（Cys46、Cys230）对于AtVKOR-DsbA的功能无明显的影响。