禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)感染鸡引起病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征、慢性呼吸道疾病等多种疾病,并造成机体的免疫抑制。P10是由ARVS1基因编码的非结构蛋白,为Ⅰ型跨膜蛋白,是ARV一个重要的毒力因子。已有研究表明,p10能够诱导细胞凋亡和融合,同时其自身在细胞内能够发生快速降解,然而ARV p10在细胞内作用的分子机理尚不清楚。本研究以ARV s1133毒株感染鸡成纤维细胞系(DF-1)为模型,分析p10在ARV致病中的作用与分子机理。研究中将p10基因进行克隆与表达,构建pEGFP-C1-p10真核表达载体,并将其转染DF-1细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。试验结果表明,DF-1细胞表达p10蛋白引起细胞凋亡。为了进一步探索p10引起的细胞凋亡和自身快速降解的分子机理,本研究利用酵母双杂交技术,以ARV p10为“诱饵”蛋白从鸡脾脏cDNA文库中筛选与其相互作用的宿主细胞靶蛋白,结果筛选到了与p10相互作用的靶蛋白溶酶体相关膜蛋白-1(Lysosome Associated Membrane Protein-1, LAMP-1)。进一步利用免疫共沉淀实验验证了两种蛋白在BHK-21和DF-1细胞中的相互作用。激光共聚焦显微镜实验结果表明,LAMP-1与p10在细胞内能够很好的共定位,呈点状分布,且两者共定位在细胞内的溶酶体上。本研究发现p10在细胞内的半衰期非常短,为了探究其降解途径,我们将蛋白酶体抑制剂MG132加入细胞培养液中,检测p10的半衰期,结果MG132能够明显抑制p10的降解,延长其半衰期,说明p10的降解与蛋白酶体有关。由于蛋白质只有发生泛素化后才能通过泛素-蛋白酶体途径进行降解,所以我们又检测了p10的泛素化情况,结果表明,p10能够同时发生K48和K63位的泛素化,该结果说明p10能够通过泛素-蛋白酶体途径发生迅速降解。为进一步探索LAMP-1与p10的相互作用对p10诱导的细胞凋亡以及自身降解的影响,我们利用siRNA技术沉默DF-1细胞内源LAMP-1蛋白的表达,转染pRK5-flag-p10和HA-Ub真核表达载体,检测p10蛋白在细胞内泛素化和表达情况。实验结果表明,当抑制了细胞内源LAMP-1的表达后,p10的泛素化水平受到了抑制,表达量明显增多,ARV感染后细胞内的p10含量也显著增多(p<0.05)。为了检测p10表达量的变化对p10功能的影响,我们通过沉默细胞内源的LAMP-1提高p10表达量,并检测p10引起的细胞凋亡和细胞融合情况。实验结果表明,P10表达量的增多促进细胞凋亡和细胞融合,并最终增加病毒的释放。为进一步验证LAMP-1对p10表达量的影响,我们在DF-1细胞中过表达LAMP-1和p10,并检测p10在细胞内的表达情况。结果发现过表达LAMP-1,细胞内p10的表达量明显减少,说明LAMP-1具有抑制p10表达的作用,并且该作用具有剂量依赖性,随着LAMP-1表达量的增多,p10在细胞内的表达量逐渐减少。综上所述,本研究证实p10能够诱导DF-1细胞凋亡,进一步发现p10在宿主细胞内与LAMP-1蛋白发生相互作用,二者互作直接影响p10的泛素化,促进p10在细胞内的降解,影响p10诱导的细胞凋亡和细胞融合,进而影响病毒的释放。该研究结果揭示了宿主细胞LAMP-1在p10降解和抗ARV感染中发挥重要作用,初步揭示了p10引起细胞凋亡以及自身降解的分子机制,为解析ARV的致病机理和研制新型疫苗提供了参考依据。