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油菜（Brassica napus）是我国长江中下游区域重要经济油料作物,为我国植物油脂生产提供原料。植物油脂不仅是食用油的主要组成部分,更是生物柴油的原料。植物油脂产量提高可以缓解我国能源不足、环境污染的现状,更能直接解决我国食用油脂依赖进口来源的问题。植物油脂主要是以三酰甘油（TAGs）形式贮存在种子中,三酰甘油的形成需要酰基辅酶A结合蛋白（Acyl-CoA-bindingproteins,ACBPs）将脂肪酸转运至内质网,从而实现三酰甘油的积累。但ACBPs在油脂合成途径中的功能机制目前并未研究透彻。因此,探究ACBPs对油菜种子中油脂合成途径的影响以及其调控油菜籽油脂合成途径的机制,为油菜高含油量和高品质育种提供重要的线索。本研究以授粉后25天低含油量油菜种子（25DAPLFA）和授粉后25天高含油量油菜种子（25DAP HFA）为实验对象,通过磷酸化蛋白组比较分析,发现BnaA05g36060D在LFA磷酸化水平高于HFA,并命名为BnACBP6。通过对编码该蛋白的基因进行生物信息学分析,组织表达模式分析,亚细胞定位分析以及蛋白磷酸化功能分析,探究BnACBP6对油菜种子中三酰甘油合成的影响以及其作用。所得研究结果如下:1.BnACBP6编码胞质酰基辅酶A结合蛋白ACBPs是一类具有胞质酰基辅酶A结合功能的管家基因,其中BnACBP6基因CDS为650 bp,编码92个氨基酸。构建pET32a-BnACBP6重组质粒转化大肠杆菌BL21,成功诱导出His-BnACBP6,蛋白分子量为30 kDa。构建PC2300-NGFP-BnACBP6重组质粒并转入农杆菌中,侵入烟草下表皮细胞后,GFP荧光信号显示BnACBP6蛋白亚细胞定位于细胞质基质,与AtACBP6一致。BnACBP6在不同物种间氨基酸相似性达到90%以上,系统进化树分析表明BnA CBP6与AtACBP6同源。BnACBP6蛋白二级结构分析和蛋白三级结构预测表明BnACBP6具有ACBPs家族共有的酰基辅酶A结合域。2.BnACBP6在种子油脂合成时期高表达利用荧光定量PCR检测野生型甘蓝型油菜各个组织中BnACBP6表达量,发现BnACBP6在25 DAP种子中高表达。进一步分析BnACBP6在HFA和LFA不同发育时期（15,25,35,45,50 DAP）种子表达量,结果显示,BnACBP6在整个种子油脂合成时期优势表达。该结果说明,BnACBP6蛋白参与了油菜种子油脂合成的整个过程。3.BnACBP6蛋白在LFA种子中磷酸化水平较高前期差异磷酸化蛋白组的研究发现,BnACBP6蛋白的磷酸化主要发生在第88位丝氨酸残基。针对BnACBP6第88位磷酸化位点设计了十四肽序列后,制备BnACBP6磷酸化抗体和非磷酸化抗体,用以检测HFA和LFA授粉后25天种子总蛋白,结果发现:在HFA和LFA中,BnACBP6蛋白总量没有差异,但在LFA中磷酸化BnACBP6蛋白表达量是HFA中的1.5倍。结果说明BnACBP6蛋白磷酸化可能影响油菜种子油脂合成。4.过量表达BnACBP6促进油菜种子脂肪酸的积累分别构建了BnACBP6过量表达以及第88位丝氨酸点突变重组质粒,通过农杆菌侵染下胚轴转化方法,获得油菜转基因材料。利用气相色谱分析转基因材料种子中TAGs含量和脂质组分,结果显示相较于野生型,BnACBP6过量表达以及丝氨酸未磷酸化油菜籽中TAGs含量上升;脂质组分分析显示,BnACBP6过量表达以及磷酸化位点点突变油菜籽中C18:1脂肪酸含量下降,C20:1和C22:1脂肪酸含量增加。该结果表明,BnACBP6丝氨酸未磷酸化和过量表达促进脂肪酸向内质网转运,超长链脂肪酸的积累。5.BnACBP6与E3泛素连接酶Bn0351相互作用利用免疫共沉淀与质谱联用技术筛选BnACBP6互作蛋白,结果发现E3泛素连接酶Bn0351和蛋白激酶Bn3674可以与BnACBP6互作。通过pull-down和CoIP技术验证了 BnACBP6与Bn0351存在互相作用。6.BnACBP6蛋白磷酸化影响蛋白质稳定性提取BnACBP6丝氨酸磷酸化位点点突变转基因油菜种子总蛋白,利用GFP抗体定量,泛素抗体检测。结果表明,磷酸化BnACBP6蛋白泛素化水平更高。在烟草叶片中注入BnACBP6过量表达以及丝氨酸磷酸化位点点突变重组质粒,72h后提取叶片总蛋白,GFP抗体检测蛋白水平,结果显示,丝氨酸磷酸化后BnACBP6蛋白稳定性更低。这说明,BnACBP6蛋白磷酸化影响其蛋白稳定性,从而影响BnACBP6在种子中油脂合成的功能。在cell free蛋白降解系统中外源添加BnACBP6蛋白后,分别加入DMSO和蛋白酶体抑制剂MG132。Western检测两组0,30,60,90,120min BnACBP6蛋白降解程度,结果显示BnACBP6能被泛素化。同时通过cell-free降解实验检测了,磷酸化BnACBP6和未磷酸化BnACBP6降解速率。结果表明,磷酸化BnACBP6降解速率加快。推测BnACBP6与Bn0351互相作用后,BnACBP6蛋白被由Bn0351参与的泛素/26s蛋白酶体途径降解,磷酸化BnACBP6会加快降解,从而影响BnACBP6在油菜种子中油脂合成过程的功能。