IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)，是以反复发作性肉眼血尿或显微镜下血尿为主要临床特征、以肾小球系膜区IgA（或包含IgG）免疫复合物沉积为免疫病理特征的一种常见的原发性肾小球肾炎，其病因和发病机制的研究已取得了长足进展，但仍不十分清楚。目前认为，遗传、环境和免疫因素共同决定了IgA N的发生。临床观察和实验室研究均证明黏膜感染损伤与IgAN发病的密切关系。现有研究资料表明，黏膜感染与损伤可引起黏膜免疫反应和黏膜免疫异常，黏膜免疫异常使黏膜淋巴组织 IgM+B细胞分化为 IgA抗体分泌细胞（IgA antibody-secreting cells，ASC)，并归巢错位迁移至全身循环中，错位迁移的ASC分泌异常糖基化的IgAl沉积在肾小球系膜引起IgAN。由此可见，黏膜感染损伤及黏膜免疫异常可能是IgAN发病机制的源头，黏膜损伤后的发病机制有待进一步弄清。　　我们前期研究从黏膜免疫诱发的IgAN动物模型中已阐明了肠黏膜屏障损伤是IgAN发病机制中的条件之一，大黄酸具有对肠道黏膜屏障的保护作用使IgAN动物肠黏膜结构损伤和功能障碍得以减轻或恢复，改善了肾脏病理改变和疾病活动性。但是IgAN动物模型肠黏膜屏障损伤后，肠黏膜所发生的免疫应答性在IgAN发病机制中的作用还不甚清楚。因此，本文从肠黏膜所发生的免疫应答以及对IgA+B细胞类别转换的影响、天然免疫在IgAN发病过程中的作用多处环节探讨IgAN的免疫学发病机制，并观察大黄酸在各个环节中的作用以探讨大黄酸的作用机制，为大黄酸的临床应用提供理论依据。　　第一部分黏膜免疫源性IgA肾病动物模型的构建、鉴定　　目的：建立黏膜免疫源性IgAN大鼠和小鼠动物模型，观察IgAN模型动物血液和尿液的生化指标、肾组织病理改变及肾脏IgA沉积情况，为探讨IgAN黏膜免疫发病机制及探讨IgAN的防治提供基础。　　方法：20只SD雄性大鼠随机分成两组，即正常对照组和IgAN模型组（n=10），利用牛血清白蛋白（BSA）+脂多糖（LPS）+四氯化碳（CCL4）联合方法建立IgAN大鼠模型，10周末处死动物。30只C57BL/6小鼠随机分成2组，即正常对照组（n=10）和IgAN模型组（n=20），采用口服BSA，及联合尾静脉注射BSA和葡萄球菌肠毒素B（SEB）的方法来诱导构建IgAN小鼠模型。12周末处死动物。观察各组大、小鼠24h尿蛋白定量(UP)、血清肌酐(CR)、尿素氮(BUN)、血清总蛋白(TP)、谷丙转氨酶（ALT）浓度变化；ELISA法检测血清中IgA的浓度；苏木素-伊红（HE）、Periodic Acid-Schiff（PAS）染色观察各组大、小鼠肾脏的病理变化；免疫荧光检测肾小球免疫球蛋白A（IgA）沉积。　　结果：IgAN大鼠模型生化检查结果显示：正常对照组和IgAN模型组24-UP（mg）分别为2.6±0.8，9.0±2.1；血清ALT（U/L）浓度分别为28.0±5.0，46.6±13.1；血清TP（g/L）浓度分别为75.7±2.8，63.6±1.1；血清中IgA（μg/L）浓度分别为63.9±9.0，92.1±11.3。与正常对照组比较，IgAN模型组大鼠24-UP升高（P＜0.01），血清ALT浓度升高、TP浓度降低（均P＜0.05），血清中IgA浓度升高（P＜0.05）。IgAN小鼠模型生化检查结果显示：正常对照组和IgAN模型组24-UP（mg）分别为1.2±0.2，3.2±0.5；血清中IgA（μg/L）浓度分别为42.6±7.5，60.5±10.2。与正常对照组比较，IgAN模型组小鼠24-UP升高，血清中IgA浓度升高（均P＜0.05）。肾脏组织病理学显示，正常对照组大、小鼠肾小球体积、形态正常，细胞外基质及肾小管未见形态学病理改变，肾小球系膜区未见IgA沉积；IgAN模型组大、小鼠均可见不同程度肾小球体积扩大，肾小球系膜细胞数增多，系膜基质增生。免疫荧光检测IgAN模型组大、小鼠均可见肾小球系膜区有颗粒状至团块状的IgA沉积，尤以IgAN模型组小鼠IgA沉积更为明显。　　结论：黏膜免疫诱导方法均可稳定构建IgAN大、小鼠模型。是一种探讨黏膜免疫参与IgAN的发病机制较为理想的造模方法。　　第二部分IgA肾病大鼠Peyer结T细胞亚群及IgA+B细胞的变化　　目的：观察黏膜免疫源性IgAN大鼠Peyer结中Th、Ts、Treg和TCRγδT细胞的变化以及T细胞亚群及细胞因子的变化。　　方法：建立黏膜免疫致IgAN大鼠模型，随机分成正常对照组、IgAN模型组。10周末采用用流式细胞仪测定各组肠Peyer结CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD25+T细胞、TCRγδT细胞亚群的百分比变化；ELISA方法检测血清中Th1类细胞因子IFN-γ和Th2类细胞因子IL-4含量；测定各组肠Peyer结和骨髓中IgA淋巴细胞（IgA+）、IgA+B淋巴细胞（IgA+B220+）、IgA+浆细胞（IgA+B220）的百分比和RT-PCR检测各组肠Peyer结TGF-β1、CD40LmRNA的表达；用RT-PCR和Western-Blot技术检测肠Peyer结BAFF、APRIL的表达。　　结果：流式细胞仪结果显示：正常对照组和IgAN模型组肠Peyer结CD4+T细胞、CD8+T细胞的百分比和CD4+/CD8+的比值分别为（58.8±5.0、35.5±12.6、1.8±0.9），（71.0±7.3、25.0±15.3、3.0±1.6）。和正常对照组相比，IgAN模型组肠Peyer结中CD4+T细胞百分比和CD4+/CD8+的比值升高，CD8+T细胞的百分比降低，具有统计学差异（均P＜0.05）；CD4+CD25+T细胞、TCRγδT细胞的百分比均有升高，但无统计学意义（P＞0.05）；ELISA结果显示：正常对照组和IgAN模型组血清 IFN-γ、IL-4分别为（59.4±14.6?g/L、19.7±6.9?g/L），（46.4±8.8?g/L、31.2±9.1?g/L）。和正常对照组相比，IgAN模型组IFN-γ降低、IL-4升高，具有统计学差异（均P＜0.05）；流式细胞仪结果显示：正常对照组和IgAN模型组肠Peyer结中IgA淋巴细胞、IgA+B淋巴细胞、IgA+浆细胞的百分比分别为（24.4±2.6、23.1±2.2、1.1±0.3），（35.0±5.4、32.7±4.9、1.9±0.5）。和正常对照组相比，IgAN模型组肠Peyer结中IgA淋巴细胞、IgA+B淋巴细胞、IgA+浆细胞的百分比升高，具有统计学差异(均P＜0.05)；正常对照组和IgAN模型组骨髓中IgA淋巴细胞、IgA+B淋巴细胞的百分比分别为（10.4±2.5、10.1±2.2），（18.0±3.6、17.7±3.5）。和正常对照组相比，IgAN模型组骨髓中中IgA淋巴细胞、IgA+B淋巴细胞百分比升高，具有统计学差异（均P＜0.05）；荧光定量PCR检测结果显示在IgAN模型组中肠Peyer结TGF-β1、CD40LmRNA的表达升高，分别达到正常对照组的3倍和2.5倍，具有统计学意义（P＜0.05）。荧光定量PCR和Western-Blot检测结果均证明了在IgAN模型组肠Peyer结BAFF mRNA和蛋白的表达与正常对照组相比，表达升高，具有统计学意义（均P＜0.05）。　　结论：IgAN模型组肠Peyer结中Th数量增多、Ts数量减少以及Th2免疫反应增强；肠Peyer结和骨髓IgA+B淋巴细胞都增加。肠Peyer结T细胞亚群及细胞因子的改变可能参与促进IgA+B细胞的转化。　　第三部分 TLR在黏膜免疫源性IgAN大鼠发病过程中的作用　　目的：观察黏膜免疫源性IgAN大鼠中肠Peyer结和肾组织Toll-like receptor4（TLR4）、TLR9和NF-κB、TGF-β1的表达情况，以探讨TLRs在IgAN大鼠发病过程的作用。　　方法：建立黏膜免疫致IgAN大鼠模型，随机分成正常对照组和IgAN模型组。10周末采用RT-PCR和Western-Blot技术检测各组肠Peyer结TLR4，TLR9的mRNA和蛋白表达的变化，以及采用RT-PCR和免疫组织化学法检测肾组织TLR4、TLR9、NF-κB、TGF-β1mRNA和蛋白表达的变化。　　结果:荧光定量PCR和Western-Blot检测结果显示在IgAN模型组肠Peyer结TLR4mRNA和蛋白的表达升高，具有统计学意义（P＜0.05）。肠Peyer结TLR9 mRNA和蛋白的表达在正常对照组和IgAN模型组中相比较，无统计学意义（P＞0.05）。免疫组化结果显示正常对照组大鼠肾脏组织切片仅见少量肾小管上皮细胞和肾小球轻度表达TLR4和NF-κB，IgAN模型组肾小管上皮细胞胞浆及肾小球表达明显高于对照组，图像分析其积分光密度显著高于正常对照组（P＜0.05）。TLR9在肾小管、肾小球均有少量表达，图像分析其积分光密度在正常对照组和IgAN模型组中相比，无统计学差异（P>0.05）。TGF-β1在正常对照组大鼠，肾脏组织切片仅见少量肾小管上皮细胞胞浆轻度表达，IgAN模型组肾小管上皮细胞胞浆及肾小球区表达明显高于对照组，图像分析其积分光密度IgAN模型组显著高于对照组（P＜0.05）。荧光定量PCR检测结果也说明了与正常对照组比较，IgAN模型组大鼠肾组织TLR4、TGF-β1 mRNA表达水平升高（P＜0.05）。　　结论:IgAN模型组肠Peyer结TLR4和肾组织TLR4、NF-κB、TGF-β1表达水平升高，提示TLR4在IgAN大鼠发病过程中发挥重要作用。　　第四部分TLR4基因敲除对IgA肾病模型小鼠干预效果的观察　　目的：建立黏膜免疫致IgAN野生型及TLR4基因敲除小鼠模型，观察TLR4基因敲除对IgAN模型小鼠血液和尿液的生化指标、肾组织病理改变、肾脏IgA沉积变化及IgA+B淋巴细胞转换情况的干预效果，论证TLR4在IgAN模型发病过程中的作用。　　方法：实验分组分为正常对照组、IgAN模型组、TLR4基因敲除对照组、TLR4基因敲除+IgAN造模组共四组。采用口服牛血清白蛋白，及联合尾静脉注射牛血清白蛋白和葡萄球菌肠毒素B的方法来诱导构建IgAN小鼠模型。12周末处死动物，观察各组小鼠24h-UP、CR、BUN、TP浓度变化；流式细胞仪测定各组骨髓中IgA淋巴细胞、IgA+B淋巴细胞、IgA+浆细胞的百分比；ELISA法检测血清IgA的浓度；HE、PAS染色观察各组小鼠肾脏的病理变化；免疫荧光检测肾小球IgA沉积；Western-Blot检测各组肾组织TLR4的蛋白表达。　　结果：正常对照组、IgAN模型组、TLR4基因敲除对照组、TLR4基因敲除+IgAN模型组共四组24-UP(mg)分别为1.2±0.2，3.2±0.5，1.4±0.2，1.8±0.3。血清中IgA(μg/L)浓度分别为42.6±7.5，60.5±10.2，45.6±8.4，50.2±8.8。与正常对照组比较，IgAN模型组小鼠24-UP升高，血清中IgA浓度升高（均P＜0.05）。与IgAN模型组比较，TLR4基因敲除+IgAN模型组明显减少24-UP和血清中IgA浓度（均P＜0.05）。流式细胞仪结果显示：正常对照组、IgAN模型组、TLR4基因敲除对照组、TLR4基因敲除+IgAN模型组共四组骨髓中IgA淋巴细胞、IgA+B淋巴细胞、IgA+浆细胞的百分比分别为（11.2±2.6、7.1±1.4、3.5±0.8），（24.5±5.2、16.7±4.2、7.9±2.4），（9.6±2.6、6.2±2.0、2.9±1.0），（15.5±3.2、9.3±2.5、4.8±1.6）。和正常对照组相比，IgAN模型组骨髓中IgA淋巴细胞、IgA+B淋巴细胞、IgA+浆细胞的百分比升高，具有统计学差异（均P＜0.05）。与IgA肾病模型组比较，TLR4基因敲除+IgA肾病模型组明显减少骨髓中IgA淋巴细胞、IgA+B淋巴细胞、IgA+浆细胞的百分比（均P＜0.05）。肾脏组织病理学显示，正常对照组、TLR4基因敲除对照组肾小球大小、形态大致正常，系膜及细胞外基质无明显增生，系膜细胞无明显增加，肾小管及间质未见明显变化，肾小球系膜区未见IgA沉积。IgAN模型组肾小球体积明显增大，肾小球内细胞数明显增多，系膜基质轻到中度增生，可见肾小球系膜区有团块状的IgA荧光沉积。相比于IgAN模型组，TLR4基因敲除+IgAN模型组小鼠上述的肾脏组织病理学特征得到明显改善，肾小球系膜区IgA沉积明显减弱。Western-Blot检测结果说明IgAN模型组肾组织TLR4蛋白与正常对照组相比，表达升高，具有统计学意义（P＜0.05）。TLR4基因敲除对照组、TLR4基因敲除+IgAN模型组小鼠肾脏均无检测出TLR4蛋白表达，说明TLR4基因在小鼠体内被成功敲除。　　结论：TLR4基因敲除改善IgAN模型小鼠血液和尿液的生化指标、肾组织病理学变化及IgA沉积和骨髓IgA+B淋巴细胞产生。证明了TLR4途径在IgAN小鼠发病过程中起具有重要作用。　　第五部分大黄酸对IgA肾病的防治效果观察及其机制的研究　　目的：建立黏膜免疫致IgAN大鼠模型，用大黄酸进行预防和治疗性干预，观察大黄酸对IgAN模型大鼠预防和治疗效果并探讨其作用机制，为大黄酸对IgAN的防治应用提供实验依据。　　方法：32只SD雄性大鼠随机分成4组，即正常对照组、IgAN模型组、大黄酸预防组和大黄酸治疗组（n=8）。利用牛血清白蛋白（BSA）+脂多糖（LPS）+四氯化碳（CCL4）联合方法建立IgAN大鼠模型。大黄酸预防组在建模前六周给予大黄酸（100mg/kg）灌胃，大黄酸治疗组在建模六周后给予大黄酸（100mg/kg）连续四周灌胃。10周末处死动物，观察各组大鼠血液和尿液的生化指标；ELISA法检测血清中IgA的浓度及免疫荧光检测IgA在肾小球的沉积；HE、PAS染色观察各组大鼠肾脏的病理变化；流式细胞仪测定各组肠Peyer结和骨髓中IgA淋巴细胞、IgA+B淋巴细胞、IgA+浆细胞的百分比和CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD25+T细胞、TCRγδT细胞亚群的百分比变化；RT-PCR检测各组肠Peyer结TGF-β1、CD40LmRNA的表达；RT-PCR和Western-Blot技术检测各组肠Peyer结TLR4，TLR9、BAFF、APRIL的mRNA和蛋白表达的变化；以及RT-PCR及免疫组织化学法检测肾组织TLR4、TLR9、NF-κB、TGF-β1 mRNA和蛋白表达的变化。　　结果：血液和尿液生化检查结果显示：与IgAN模型组比较，大黄酸预防组和大黄酸治疗组均可明显减少24-UP、ALT浓度和血清中IgA浓度，升高血清TP浓度（均P＜0.05）。肾脏组织病理学显示，大黄酸预防组和大黄酸治疗组与IgAN模型组相比，肾小球体积扩大减轻，肾小球系膜细胞未见明显增多，细胞外基质轻-中度增生，肾小球系膜区可见点状IgA沉积。与IgAN模型组比较，大黄酸预防组和大黄酸治疗组降低了肠Peyer结中IgA+B淋巴细胞、CD4+T细胞百分比和CD4+/CD8+的比值，升高了CD8+T细胞的百分比（均P＜0.05）；减少了肠Peyer结TGF-β1、CD40L mRNA含量和BAFF、TLR4 mRNA和蛋白的表达（均P＜0.05）；免疫组化图像分析积分光密度显示，大黄酸预防组和大黄酸治疗组降低肾组织TLR4、NF-κB、TGF-β1表达水平。　　结论：大黄酸预防和治疗用药对IgAN大鼠均可明显减少蛋白尿、改善血液和尿液的生化指标、减轻肾脏组织病理学改变、并显著减少肾小球系膜区IgA沉积，显示较好的防治效果，尤以预防性用药效果更佳。其机制可能与大黄酸调节Peyer结微环境、抑制了IgA+B细胞类别转换及血清IgA的分泌、阻断肾组织TLR4、NF-κB介导的炎症级联反应及阻止了TGF-β1所致肾组织纤维化过程有关。