细胞粘附分子(CAM)是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互识别、粘附和信号传导的重要信号分子。在神经系统中,神经细胞粘附分子对于脑组织结构、神经元生长、建立突触连接及神经细胞间相互作用等方面都有重要作用。神经细胞粘附分子NB-3是1996年发现的粘附分子,属于免疫球蛋白超家族的Contactin亚家族,集中表达于神经系统。目前对于NB-3功能的研究报道不多,主要围绕少突胶质细胞的分化和成熟。而其特有的表达特点和典型的免疫球蛋白超家族结构特征,都提示其可能与神经系统发育过程中轴突的生长、突触的可塑性、神经纤维的成束,以及学习和记忆等功能有关。本研究的主要目的是检测NB-3在发育不同时期的表达及其在神经元生长中的作用。基于以上目的,我们的研究内容主要包括:(1)观察NB-3在神经系统发育不同时期的表达; (2) NB-3缺失后对神经元生长的影响; (3)低氧对神经元生长的影响及NB-3的可能作用。低氧作为一种生理性的刺激因素,在神经系统的发生、发育及正常功能的维持中都具有重要的作用。而NB-3作为一个细胞粘附分子与神经元的生长可能有重要的关系。因此,本文模拟体内生理性低氧环境初步探讨了在此环境下体外培养神经元的生长及NB-3对神经元生长的影响。研究结果如下:1. NB-3在神经系统发育不同时期的表达我们利用带有Lac Z基因标签的NB-3杂合子小鼠,采用X-gal染色的方法对NB-3在神经系统发育不同时期(E12、E14、E16、E18、P0、P7、P14及成年小鼠)的脑组织中的表达进行了研究。结果发现NB-3在发育和成体小鼠中枢神经系统中均有表达,且不同时期的表达部位和表达量均有所不同。胚胎期:NB-3在胚胎发育期间从E14开始有微弱的表达,后逐渐在侧脑室周围、皮层、丘脑、下丘脑及海马等部位表达;出生后短期:NB-3在出生后表达明显升高,在P7时表达最高,此后稍有下降直至成年;成年期:NB-3在成年小鼠大脑组织中的表达分布广泛。表达最强的部位分别是:大脑皮层的II/III、V层、梨状皮层、杏仁核周皮质、丘脑、下丘脑以及海马的CA1区等。2. NB-3缺失后对皮层神经元生长的影响鉴于NB-3在皮层部位高表达,本实验主要研究了神经粘附分子NB-3对皮层神经元生长的影响。我们分离培养了来自胚胎18天野生型和NB-3基因敲除小鼠的皮层神经元,分别观察了NB-3缺失对体外培养的神经元存活和突起生长的影响。结果显示:(1)运用X-gal染色和免疫荧光染色的方法,对NB-3的表达进行了观察。结果显示NB-3在体内和体外的皮层神经元中都有表达。NB-3在胚胎18天的脑组织皮层部位的表达主要集中在II/III层。在体外培养的E18小鼠皮层神经元中,NB-3主要集中在胞体的位置,在突起上也有部分表达;(2)进一步用MTT法分别检测野生型和NB-3基因敲除小鼠的皮层神经元的存活,发现NB-3缺失后,在体外培养的1d和3d时神经元存活的数目明显低于野生组;(3)用考马斯亮蓝染色的方法,在神经元体外培养24h后,对出芽率阳性的细胞进行统计,发现NB-3缺失后神经元的出芽率明显低于野生组;(4)同样用考马斯亮蓝染色的方法,对神经元最长突起的长度进行定量分析。发现在体外培养的1d和3d后,NB-3基因敲除组细胞突起的长度都明显比野生组短。3.低氧对神经元生长的影响及NB-3的可能作用在胚胎发育过程中,细胞始终是处于一种低氧环境中的。已有文献报道,1%~3%低氧能够促进NSC向神经元方向分化,并有促进体外培养神经元生长的作用。本实验采用3%的生理性低氧环境,观察了在此条件下体外培养的皮层神经元的生长,以及初步探讨了NB-3在神经元生长中的作用。结果显示:(1)分离培养的神经元分别放在常氧和低氧环境中培养3d,神经元的标记分子MAP2的免疫细胞化学染色结果表明,低氧组MAP2阳性细胞数目明显高于常氧组;(2)用MTT比色法检测,结果显示与常氧组比较,低氧对来源于野生型和NB-3缺失小鼠的皮层神经元的存活都有促进作用;(3)进一步对神经元生长1d时的出芽率分析,结果显示和常氧组相比,低氧对体外培养的神经元的出芽率没有明显影响;(4)对神经元突起长度的定量分析发现,在体外培养1d时,常氧组和低氧组的神经元突起长度也没有明显变化。然而在体外培养3d时,低氧组的细胞突起长度则明显长于常氧对照组;(5)实验进一步观察了在低氧条件下NB-3 mRNA及低氧反应核心因子HIF-1αmRNA的表达。RT-PCR检测结果显示NB-3和HIF-1αmRNA水平的表达在低氧环境下没有明显的改变。综上所述,NB-3在中枢神经系统中是广泛表达的。NB-3缺失后不仅减少了神经元存活的数量,同样对神经元突起的延伸长度产生了影响。低氧环境可以一定程度上促进细胞的存活和生长。以上研究结果表明,NB-3在神经系统中具有重要作用,其作用机制还需进一步的研究。