脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一，约占全部脑肿瘤的45～55％。目前，脑胶质瘤的治疗手段已由单一的手术治疗发展到手术加放疗和化疗等综合治疗。　　 恶性胶质瘤的首选治疗是手术切除。导航以及术中头颅MRI和CT的应用，能实时指导术中的肿瘤切除。但是胶质瘤的特点是肿瘤细胞沿着白质和脑室壁周围侵润性生长，通常超过了手术医生以及影像学所界定的范围。因此胶质瘤的其他治疗尤显重要，化疗是治疗胶质瘤的重要手段之一。　　 但由于相当部分胶质瘤易对化疗药物耐药，目前化疗总体疗效仍不甚理想。现已发现某些特定基因异常表达可影响胶质瘤的化疗耐药性，诸如MGMT，Survivin和p53等。然而单个基因并不能准确预测胶质瘤对化疗药物的敏感程度并预示患者预后，胶质瘤的化疗反应性往往决定于多个基因甚至基因群的改变，因此，寻找新的耐药基因并阐明其分子耐药机制已成为神经外科研究的热点之一。　　 我们前期对72例行基因芯片检测的胶质瘤病例进行临床随访，通过生物信息学技术（包括GO-analysis; Pathway-analysis和Signal-net等）筛选与化疗耐药相关的差异表达基因，寻找到29 条可能与化疗耐药相关的基因。其中细胞周期蛋白依赖激酶-6 （cyclin-dependent kiase 6 CDK6）即是其中的一条基因。　　 细胞的异常增殖和细胞周期的的紊乱是细胞在异常信号刺激下导致癌变的常见的一个方面。实际上，在多个机制的调节下，CDK4/6-CyclinD/ INK4/ Rb通路的普遍失调节以及高度活化已经在多个肿瘤中被描述。在肿瘤的发展过程中，CDK4/6的高度活化是正调节因子的过表达，内源性抑制剂的沉默，以及他们的底物的渐进性变化的共同结果。在间质性肿瘤如肉瘤以及白血病中CDK6的活化明显增高。在胶质瘤中，Lam 发现在14例胶质母细胞瘤中12例出现CDK6的高表达。这也提示我们如果改变CDK6的表达是否能抑制肿瘤的生长。同时，目前抗胶质瘤的药物主要是烷化剂，大部分作用于肿瘤细胞的周期，那么如果将影响细胞周期的CDK6与化疗药物共同培养是否能抑制肿瘤细胞的生长呢？　　 本研究拟检测CDK6在不同病理级别脑胶质瘤以及恶性胶质瘤细胞株中的确切表达情况，并通过敲减CDK6在胶质瘤细胞株中的表达，研究CDK6在胶质瘤细胞生长中的作用，并将敲除CDK6基因的U251胶质瘤细胞与替莫唑胺（temozolomide TMZ）　　 药物培养，检查肿瘤的耐药相关基因MDR、MRP，凋亡的相关蛋白以及胶质瘤细胞的生长曲线，研究CDK6基因在化疗耐药中的作用。本实验共分为三个部分：第一部分，CDK6在脑星形细胞胶质瘤瘤组织中的表达水平以及与病理级别的相关性；第二部分，通过RNA 干扰的方法敲减CDK6的表达观察其对U251胶质瘤细胞株增殖、凋亡等细胞表型的影响.第三部分，siRNA靶向性抑制CDK6表达与化疗药物共同培养，观察其对胶质细胞瘤化疗敏感性的影响第一部分 CDK6在脑胶质瘤组织中的表达研究目的：研究CDK6在正常脑组织、不同级别脑胶质瘤组织中的mRNA和蛋白表达水平。　　 方法：应用免疫组织化学染色检测CDK6在34例脑星形胶质细胞瘤组织和5例正常脑组织中的蛋白表达水平，应用Western blot 检测CDK6的在34例不同级别脑星形胶质细胞瘤和5例正常脑组织的蛋白表达水平。应用real-time PCR 检测CDK6mRNA的在34例不同级别脑星形胶质细胞瘤和5例正常脑组织中的表达水平。　　 结果：免疫组织化学染色提示CDK6蛋白在星形胶质细胞瘤组织中表达明显上调。　　 Western blot 结果提示CDK6蛋白在高级别胶质细胞瘤（WHO-III 449.45±20.17， IV518.61±19.61）组织中表达明显上调，与正常脑组织（16.81±3.25）相比差异有统计学意义，在低级别胶质瘤中（WHO-I 41.33±7.38,WHO-II135.11±37.54）表达亦有增高。且高、低级别胶质瘤之间差异有统计学意义（P＜0.05）。CDK6mRNA在胶质母胶质瘤（WHOIII-IV）中的表达（78.11±14.04、间变性胶质瘤（WHO-III）中的表达为（46.74±28.81），比正常组织（1.02±0.25）显著升高，相对低级别胶质瘤也升高:毛细胞型胶质瘤（WHO-I）（5.50±0.25），弥漫型星型细胞胶质瘤（WHO-II）(11.78±5.90)，差异有显著性（P＜0.05）。结论：CDK6在星形胶质细胞瘤组织中的mRNA和蛋白表达水平明显高于正常脑组织，并随着胶质瘤的级别升高而增高。提示CDK6 可能在星形细胞瘤的发生、发展过程中起重要作用。　　 第二部分靶向CDK6的RNA 干扰对U251胶质瘤细胞株凋亡和细胞周期改变的作用　　 目的：研究靶向CDK6的RNA 干扰对U251胶质瘤细胞株增殖,凋亡的作用。　　 方法：设计并合成靶向CDK6的siRNA，转染U251细胞株，优化转染条件。MTT 法测定转染后72小时U251细胞增殖率，流式细胞仪测定干扰后72小时早期细胞周期改变，蛋白芯片测定转染后72小时Clusterin、Bax、Bcl-2、P53等凋亡相关蛋白的表达水平变化。　　 结果：CDK6 siRNA 可有效敲减U251细胞CDK6的表达。经流式细胞仪检测，靶向CDK6 siRNA 转染U251细胞72小时后G1期细胞比例显著升高，较阴性对照组差异显著（59.77±1.85％vs51.07±1.33％，P<0.05）,而G2/M 期细胞的比例明显下降（21.85±1.32％vs25.93±0.50％，P<0.05），S 期细胞的比例也出现下降（19.25±0.90％vs22.99±1.08％，P<0.05）。凋亡蛋白芯片显示CLU的表达明显降低，Bax，Bcl-2, P53 无明显变化；MTT 法检测CDK6siRNA 转染组72小时的细胞生长吸光值为0.417±0.065；较阴性对照组（0.613±0.075）降低；差异均有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论：通过RNA 干扰敲减CDK6在U251胶质瘤细胞中的表达可有效抑制肿瘤细胞的增殖，其可能原因是CDK6的异常导致CDK4/6-CyclinD/ INK4/ Rb通路的障碍，由此导致细胞周期的阻滞；敲减CDK6表达可抑制CLU的表达，由此可能促进凋亡。由此可见，敲减CDK6的表达可以抑制胶质瘤细胞的增殖并且促进其凋亡，抑制CDK6表达可能作为未来胶质瘤靶向治疗的选择之一。　　 第三部分 siRNA靶向性抑制CDK6表达对U251胶质细胞株化疗敏感性的影响　　 目的：研究靶向CDK6的siRNA 转染U251胶质瘤细胞株后，细胞对TMZ 敏感性的改变。　　 方法：将鉴定有效的靶向CDK6的siRNA的转染U251细胞株，Western Blot 法检测耐药相关蛋白PARP表达水平。构建MDR 以及MRP的引物，RT-PCR 测定其表达。MTT 法测定靶向CDK6的siRNA的转染U251细胞与化疗药物TMZ 培养后24小时，48小时，72小时的增殖水平。　　 结果：有效的靶向CDK6的siRNA的转染U251细胞后MDR为(0.44±0.18)，比阴性组（3.07±0.49）和未转染组（3.09±0.27）明显降低(P<0.05)。而MRP为(1.93±1.40)，比阴性组（7.27±1.49）和未转染组（8.39±1.17）也明显降低。(P<0.05)。　　 MTT 法检测CDK6 siRNA 转染后U251细胞在TMZ中24小时，48小时，72小时的细胞生长在450nm 吸光值分别为0.081±0.007，0.155±0.017，0.298±0.016；较阴性对照组（0.111±0.0122，0.286±0.035，0.622±0.027）和未转染组（0.109±0.0123，0.326±0.048，0.613±0.019），siRNA组（0.098±0.010，0.177±0.016，0.417±0.026）降低，TMZ组（0.091±0.009，0.186±0.006，0.417±0.035）差异均有显著性(P＜0.05)。　　 结论：通过RNAi 敲减CDK6在U251胶质瘤细胞株中的表达，可有效提高肿瘤细胞对TMZ的化疗敏感性。抑制CDK6表达可以提高恶性胶质瘤细胞对于化疗药物的敏感性，可能成为恶性胶质瘤化疗方案制定的依据和靶向治疗的选择。