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人乳寡糖(HMOs)有益生、抗病毒和促进婴儿大脑发育等多种生物活性,然而人乳寡糖的合成瓶颈限制了人乳寡糖构效关系的研究,这就凸显了分离纯化天然人乳寡糖的重要性。本文以人乳为原料,经离心脱脂、除蛋白后获得HMOs粗提取物,粗品得率为53g/L,其总糖含量为92.5%(W/W),蛋白含量为3.7%(W/W)。首次联合运用低压凝胶渗透色谱、高效离子交换色谱、多孔石墨化碳色谱分离纯化技术分离获得了18个中性人乳寡糖和8个酸性人乳寡糖组分,并运用电喷雾碰撞诱导串联质谱技术(ESI-CID-MS/MS)对其进行结构解析。结果表明,获得的寡糖聚合度为3-9,且同一聚合度的寡糖有连接方式不同的异构体。在得到的18种天然中性人乳寡糖中,三糖异构体有2种,四糖异构体有2种,五糖异构体有3种,六糖异构体有2种,七糖异构体有2种,八糖异构体有4种,九糖异构体有2种：在得到的8种天然酸性人乳寡糖中,三糖异构体2种,五糖异构体2种,六糖异构体2种,七糖和八糖各1种。这些寡糖主链的二元结构核心单元Galβ1-4Glc和Galβ1-3GlcNAc或Galβl-4GlcNAc,且还原端二元结构为Gal/β1-4Glc,各二元结构之间通过β1-3或β1-6连接,Fuc可连接在Gal的C2位、Glc的C3位、GlcNAc的C3或C4位；Neu5Ac连接在GlcNAc的C6位、Gal的C3或C6位上。本文首次利用多维色谱技术将结构复杂的人乳寡糖进行分离,获得了包括不同异构体在内的26种天然人乳寡糖,并采用先进的ESI-CID-MS/MS技术确定了它们的结构序列,克服了非衍生寡糖异构体分离度较低以及寡糖异构体结构确定难的问题,为进一步从事人乳寡糖构校关系的研究奠定了方法学参考。