目的:　　 宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤，流行病学和实验研究均表明，高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染是导致宫颈癌发生的原因之一，但不是唯一因素。叶酸参与DNA的合成和DNA甲基化，其在宫颈癌中的作用日益受到关注。DNA甲基化是目前研究最为广泛的表观遗传学事件，而DNMT1作为这一过程中的关键酶，已被证实与多种肿瘤的发生有关。脆性组氨酸三联基因(FragileHistidine Triad gene，FHIT)是目前宫颈癌研究中报道最多的抑癌基因之一。其5端CpG岛的超甲基化可能是其失活的主要机制。已有研究报道，叶酸可影响DNMT1的活性;且补充叶酸可使FHIT蛋白表达升高，但叶酸是否通过DNA甲基化过程而影响宫颈癌细胞中FHIT基因的表达，目前未见相关报道。本次实验将采用体外研究方法对其加以探讨。　　 方法:　　 运用瞬时转染技术将重组质粒和空质粒导入宫颈癌C33A和Caski细胞中，设立未转染组作为对照，分别向未转染组、空质粒组和重组组中添加不同浓度叶酸，采用细胞计数检测宫颈癌细胞的生长情况，流式细胞仪分析细胞的增殖及凋亡情况，Real-time PCR检测DNMT1、FHIT及HPV16癌基因E6、E7 mRNA的表达情况，Western-blot法检测DNMT1和FHIT蛋白表达情况。　　 结果:　　 1.叶酸对宫颈癌细胞生长及DNMT1、FHIT基因表达的影响:(1)随着叶酸浓度的增加抑制率呈上升趋势(C33A: r=0.976，P＜0.001;Caski:r=0.952，P＜0.001)，除10μ g/ml浓度组外，实验组与对照组相比均有统计学意义(P＜0.05)。(2)施加不同浓度叶酸后，细胞周期增殖指数降低（C33A:r=-0.736，P=0.001;Caski: r=-0.864，P＜0.001）;凋亡率逐渐增加(C33A: r=0.776,P＜0.001;Caski: r=0.679，P=0.002)。(3)两种细胞在高浓度叶酸500μ g/ml和1000μ g/ml组中DNMT1mRNA和蛋白的相对表达量与1μ g/ml组相比有统计学意义(P＜0.05)。(4)施加叶酸干预后，C33A细胞中，1μ g/ml组FHIT基因甲基化阳性，500和1000μ g/ml组FHIT基因甲基化阴性，其余浓度组部分甲基化;Caski细胞中，500μ g/ml和1000μ g/ml组FHIT基因甲基化阴性，250μ g/ml组FHIT基因部分甲基化，其余浓度组FHIT甲基化阳性。(5)随着叶酸浓度的增加宫颈癌细胞FHITmRNA(C33A:r=0.853，P＜0.001，Caski: r=0.919，P＜0.001)与蛋白(C33A: r=0.721，P=0.001，Caski: r=0.801，P＜0.001)相对表达量呈升高趋势，在500.0、1000.0μ g/ml组与对照组(1μ g/ml)相比有统计学意义(P＜0.05)。(6)叶酸对Caski细胞HPVE6癌基因mRNA相对表达量无影响;HPVE7癌基因mRNA表达量降低（r=-0.728，P=0.001），1000μ g/ml与对照组相比有意义。　　 2.DNMT1对宫颈癌细胞生长及FHIT基因表达的影响:(1)重组质粒与空质粒经酶切鉴定，分别在291bp和290bp处获得两条重组片段。重组质粒和空质粒成功转染宫颈癌细胞C33A和Caski，转染率为65％和63％，DNMT1基因抑制率为53％和52％。(2)重组组中宫颈癌C33A和Caski细胞活细胞数减少，与未转染组相比有统计学意义(P＜0.05);细胞增殖指数降低，凋亡率升高，与未转染组和空质粒组相比有统计学意义(P＜0.05)。(3) DNMT1干扰后，未转染组与空质粒组，FHIT甲基化呈阳性，而非甲基化阴性。重组组中，出现了非甲基化条带，未见甲基化。(4)转染后，重组组与未转染组相比，FHITmRNA与蛋白相对表达量增加，且差异有统计学意义(P＜0.05);空质粒组与未转染组细胞相比表达量无明显差别。(5)DNMT1干扰对Caski细胞HPV16E6癌基因的表达量无明显影响;重组组E7癌基因相对表达量降低，与对照组相比有统计学意义(P＜0.05)。　　 3.叶酸、DNMT1对宫颈癌细胞生长及FHIT基因表达的影响:(1)宫颈癌C33A和Caski细胞中，三组细胞均随着叶酸浓度的增加活细胞数逐渐减少，未转染组与重组组除10μ g/ml组外，与对照组(1μ g/ml)相比均有统计学意义(P＜0.05)。空质粒组中各实验组与对照组(1μ g/ml)相比有统计学意义(P＜0.05)。相同叶酸浓度下，重组组与空质粒组，重组组与未转染组相比活细胞数减少，且差异有统计学意义(P＜0.05)。(2)细胞增殖，C33A细胞重组组中，随着叶酸浓度的增加周期增殖指数逐渐降低，500μ g/ml和1000μ g/ml组与1μ g/ml组相比有统计学意义(P＜0.05)。Caski细胞，空质粒组与重组组细胞均随着叶酸浓度的增加，细胞周期增殖指数逐渐降低，且500μ g/m1和1000μ g/ml组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。相同叶酸浓度下，重组组与未转染组和空质粒组相比，细胞周期增殖指数降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。随着叶酸浓度的增加，重组组与空质粒组C33A和Caski细胞的凋亡率逐渐升高，除10μ g/ml组外，其它各实验组与1μ g/m1组相比有统计学意义(P＜0.05)。相同叶酸浓度下，重组组中两种细胞的凋亡率均较未转染组和空质粒组的高，且差异有统计学意义(P＜0.05)。(3) FHIT基因甲基化，C33A细胞，空质粒组中1000μ g/ml组FHIT甲基化阴性，500μ g/ml组FHIT基因部分甲基化，其余浓度组中FHIT甲基化阳性;重组组中各叶酸浓度组FHIT基因甲基化阴性。Caski细胞，空质粒组中250μ g/ml、500μ g/ml和1000μ g/ml组FHIT基因非甲基化阳性，其余浓度组FHIT甲基化阳性;重组组FHIT甲基化阴性。(4) FHIT蛋白表达，未转染组和空质粒组细胞FHITmRNA相对表达量逐渐升高，500μ g/ml和1000μ g/ml组与1μ g/ml组相比差异有统计学意义(P＜0.05);重组组细胞FHITmRNA相对表达量同样呈上升趋势，各实验组与对照组相比均有统计学意义(P＜0.05);相同叶酸浓度下，重组组细胞的FHITmRNA相对表达量较未转染组和空质粒组的高，且差异有统计学意义(P＜0.05)。(5) C33A细胞，三组均随着叶酸浓度的增加，FHIT蛋白表达量上升，未转染组和重组组在叶酸浓度为250μ g/ml、500μ g/ml和1000μ g/ml时，与1μ g/ml组相比差异有统计学意义(P＜0.05);空质粒组中500μ g/ml和1000μ g/ml组与1μ g/ml组相比有统计学意义(P＜0.05)。Caski细胞中，未转染组与空质粒组在500μ g/ml和1000μ g/ml组，FHIT蛋白表达量与对照组(1μ g/ml)相比有统计学意义(P＜0.05)。而在叶酸浓度为250μ g/ml、500μ g/ml和1000μ g/ml时，重组组细胞FHIT蛋白表达量与1μ g/ml组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。相同叶酸浓度下，除C33A细胞250μ g/ml组和Caski细胞10μ g/ml组外，重组组FHIT蛋白相对表达量较未转染组和空质粒组的高，差异有统计学意义(P＜0.05)。(6)叶酸干预、DNMT1干扰对宫颈癌Caski细胞HPV16E6癌基因无明显影响;三个组中E7mRNA的表达水平均随着叶酸浓度的增加，表达降低。　　 结论:　　 1.高浓度叶酸可抑制DNMT1表达;使FHIT基因发生去甲基化，FHIT蛋白恢复表达。　　 2.DNMT1基因可影响FHIT基因的甲基化状态及表达。　　 3.补充叶酸、DNMT1表达降低对宫颈癌细胞的生长增殖抑制具有协同作用。　　 4.补充叶酸、DNMT1表达降低可使宫颈癌细胞FHIT基因发生去甲基化并恢复表达，二者具有协同作用;DNMT1干扰后再施加叶酸干预，FHIT基因表达水平进一步升高，提示叶酸可能通过降低DNMT1表达水平而使FHIT基因表达升高。　　 5.补充叶酸、DNMT1表达降低对宫颈癌Caski细胞HPV16 E6癌基因表达无影响，但可降低E7癌基因的表达，对Caski细胞的增殖抑制作用可能与E7癌基因的表达改变有关，但具体机制有待进一步研究。