团头鲂JUNCTOPHILIN家族基因的分子克隆和表达研究

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Junctophilin(JPH)被认为是膜耦联复合物的主要组成成分,它在维持横纹肌细胞超微结构、兴奋收缩耦联、Ca2+信号传导等方面扮演着重要的角色。JPH1和JPH2主要在横纹肌中表达,而肌肉是人类食物中重要的蛋白质来源。然而JPHs大多的研究都集中在哺乳动物上,在鱼类上的研究还很缺乏。因此探究Jphs在鱼类中潜在的功能具有重要的意义。本研究以我国重要的草食性淡水经济鱼类,团头鲂(Megalobrama amblycephala)为研究对象,克隆了团头鲂jphs基因家族的四个基因,jph1a、jph1b、jph2和jph3,分析了其序列特征以及时空表达谱;鉴定了Jph1a、Jph1b和Jph2的亚细胞定位;并分析了干扰jph1b对肌肉发育相关基因表达和细胞增殖的影响。主要研究结果如下:1)团头鲂jphs基因的克隆及序列分析团头鲂jph1a、jph1b、jph2和jph3基因的cDNA长度分别为2031 bp、2016 bp、2358 bp和2361 bp,各自编码676、671、785和786个氨基酸。团头鲂jphs均由5个外显子和4个内含子组成,与大多数物种的JPHs基因结构相似。生物信息学分析显示这几个基因在不同物种中非常保守,且都是由8个MORN(Membrane occupation recognition nexus)结构域和一个TM(Transmembrane motif)结构域组成。进化树结果显示,脊椎动物JPHs分为四个不同的分支,其中JPH1和JPH2关系较近。2)团头鲂jphs在不同组织及不同发育时期的表达变化荧光定量PCR结果表明,团头鲂jph1a、jph1b、jph2和jph3在不同组织中呈现特异表达的模式,其中,jph1a、jph1b、jph2在心脏和肌肉中表达量最高,jph3主要在心脏、脑、血液中表达。此外,jph1a依次在血液、脑、脾脏等组织中也有较高的表达;jph1b在脑和脾脏中表达量较高;jph2在血液中有较高的表达。团头鲂jph1a、jph1b、jph2和jph3在胚胎发育早期的表达模式相似。在胚胎期,它们在囊胚期到原肠期表达水平上调达到第一个峰值(jph3除外),然后在体节出现期表达水平快速下降,直到心跳期表达水平上升到第二峰值。出膜后,jphs的表达一直处于较低水平直到1525 d表达水平上升到第三峰值。3)团头鲂Jph1a、Jph1b和Jph2的亚细胞定位将团头鲂jph1a、jph1b和jph2的ORF序列分别克隆到pGEFP-N1和pGEFP-C1表达载体中,并转染到FHM细胞中,DAPI染色后,在荧光显微镜下观察其在细胞中的定位情况。结果显示,团头鲂Jph1a、Jph1b和Jph2在细胞中呈泛表达。4)Ca2+处理细胞对jph1b表达的影响用不同浓度的CaCl2处理FHM细胞12 h后,发现在100μmol/L和500μmol/L Ca2+的刺激条件下,jph1b的表达会被抑制。5)干扰jph1b的表达对肌肉发育相关基因以及细胞增殖的影响利用siRNA技术抑制jph1b的表达后,myod基因的mRNA呈现出表达上调的趋势,而myog、myf5和myf6的表达水平显著降低,推测jphs可能在鱼类肌肉发育中起重要作用。利用CCK8试剂盒检测干扰jph1b表达后对细胞增殖的影响,结果显示当抑制jph1b基因的表达后可以促进细胞增殖。
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