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目的:IL-27是新近发现的一类细胞因子。它可以通过调节T细胞、B细胞及NK细胞的功能增强对某些肿瘤细胞的杀伤作用。目前己成为肿瘤基因治疗中一个新的候选目的基因。本研究拟获得稳定表达小鼠IL-27(mIL-27)基因的小鼠结肠癌细胞株(Colon26),研究IL-27基因对小鼠结肠癌细胞体内外生物学性状的影响,以期为今后结肠癌的基因治疗提供理论依据。
方法:1.脂质体法将pcDNA3.1(+)-His(B)/mIL-27质粒转染COS-7细胞进行瞬时表达,Westem-blot检测表达的IL-27蛋白。同时转染pcDNA3.1(+)-His(B)做对照。
2.脂质体法将pcDNA3.1(+)-His(B)/mIL-27质粒转染Colon26结肠癌细胞,经G418筛选后获得稳定表达mIL-27的细胞克隆Colon/IL-27。同时转染pcDNA3.1(+)-His(B)做对照。采用Western-blot、ELISA、RT-PCR法证实IL-27基因成功转染Colon26并表达。
3.用MTT比色法分别检测Colon26/IL-27细胞、Colon26/HisB和野生Colon26细胞的生长增殖情况;流式细胞术检测IL-27质粒转染后对Colon26细胞凋亡的影响。
4.动物实验:将小鼠随机分为三组,即:IL-27组、空质粒对照组、对照组,分别地将Colon26/IL-27细胞、Colon26/HisB细胞、Colon26细胞接种于BALB/c小鼠的右侧背部皮下。从第5天开始,每隔3天测一次肿瘤大小,按公式V=ab2/2计算肿瘤体积,同时观察其生存期以了解其致瘤性。结果:1.采用Westem-blot法证实IL-27质粒成功转染COS-7细胞并表达IL-27。
2.建立了可表达mIL-27的小鼠结肠癌细胞株Colon26/IL-27。1)RT-PCR证实,外源mIL-27基因已整合到Colon26/IL-27细胞的基因组中。2)经Western-blot法检测,只有在Colon26/IL-27细胞中有代表目的蛋白的的特异性条带出现。3)用ELISA法定量检测细胞裂解上清中所表达的IL-27显示,转染IL-27细胞组OD值(0.812±0.045)明显高于作为对照的转染空质粒细胞组(0.127±0.009)和Colon26细胞(0.115±0.007)。
3.实验组Colon26/IL-27细胞和对照组Colon26/HisB,Colon26细胞的大小、形态、生长增殖,细胞凋亡相关蛋白以及细胞周期等方面的生物学特性均无显著差异。
4.动物荷瘤实验中,实验组、空质粒组、对照组肿瘤体积分别为:(1.922±0.163)cm3、(4.906±0.134)cm3和(4.418±0.401)cm3,实验组的肿瘤明显小于两个对照组;实验组、空质粒组、对照组生存期分别为:(6 5±2.89)d、(40±1.24)d和(39±1.43)d,实验组生存期也长于对照组。
结论:
1.pcDNA3.1(+)-His(B)/mIL-27质粒成功转染结肠癌细胞,并建立了稳定表达IL-27的细胞克隆Colon26/IL-27。
2.IL-27基因转染对Colon26细胞的生物学特性无直接影响。
3.在荷Colon26/IL-27细胞鼠,肿瘤生长减慢,生存期延长,其机制有待于进一步的研究。