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杀菌/通透性增强蛋白（bacteriacidal/permeability-increasing protein,BPI）是一种分子量为55 KD的阳离子蛋白（简称BPI55），具有抑制和杀伤G - 菌，结合、中和内毒素，促进补体活化，增强调理吞噬，抑制炎症介质生成等功能。重组人BPI N端前199个氨基酸（分子量为23KD的蛋白片段，简称BPI23）保留了完整人天然BPI（nBPI55）的全部生物活性。BPI23分子量较小易于光滑型LPS结合，对光滑型大肠杆菌的活性约是完整BPI的30倍。人酸性成纤维细胞生长因子（human acidic Fibroblast Growth Factor ,haFGF）是成纤维细胞生长因子家族成员之一，能够诱导多种细胞分化、增殖，具有营养和保护神经元、促进损伤修复、诱导缺血区血管形成、促进伤口愈合等功能。创伤愈合是个漫长的过程，在临床治疗过程中仍存在不少障碍，容易受到细菌等感染，引起菌血症或脓毒血症，产生全身炎症反应综合症（SIRS），继之形成多脏器功能障碍综合症（MODS）。将BPI功能性N端BPI23基因和haFGF基因通过非极性疏水柔性肽段（Gly4Ser）3的Linker拼接成BPI23-haFGF融合基因，然后克隆到巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）分泌型表达载体pPICZαA进行表达，并对该基因的表达产物进行生物活性研究，为能开发出一种既能缩短创伤愈合时间、提高愈合质量又能避免细菌感染的双功能新型多肽类药物打下基础。
研究方法与结果：
①借助Primer Premier 5.0设计2条特异引物，以用Gene SOEing(Gene splicing by overlap extension)技术拼接的带信号肽的BPI23-haFGF融合基因为模板，PCR扩增获得到约1.1 kb DNA片断，克隆至pUCm–T载体序列测定，序列包括编码无信号肽BPI N端前199个氨基酸基因、编码（Gly4Ser）3 的Linker基因和不含终止子的 haFGF基因，大小为1107 bp。BLAST结果表明：融合基因前段与Genebank上的BPI mRNA序列（登录号：4502446) 同源性为99％，融合基因后段与Genebank上的haFGF mRNA序列（登录号：15055546)完全一致。
②扩增pUCm -BPI23-haFGF质粒，用Kpn I / Not I切下BPI23-haFGF基因片断，并定点克隆至经相同双酶切的真核表达载体pPICZαA中，构建pPICZαA-BPI23-haFGF分泌表达载体，测序分析，获得编码正确的重组表达载体pPICZαA-BPI23-haFGF。生物信息学软件分析预测编码融合蛋白序列，396个氨基酸，分子量43.5 KD，pI 为9.24，具有BPI23和haFGF两个保守结构域，且BPI23保守区序列99％同源，haFGF保守区序列100 ％同源。
③将SacⅠ线性化的pPICZαA-BPI23-haFGF电转化至毕赤酵母宿主菌X-33中，Zeocin抗性筛选、PCR鉴定后获得稳定工菌株X-33/pPICZαA-BPI23-haFGF；0.5％甲醇诱导工程菌表达，浓缩上清经15％分离胶SDS-PAGE分析和6×His标签一抗Western Blot鉴定，在约43.5 KD有特异性条带，与目的融合蛋白预测大小相符，表达量为10～20 μg /ml。
④优化诱导表达条件，探索不同诱导时间、不同温度、不同甲醇浓度和不同pH进行对表达量的影响，结果发现：28℃、pH5.0、甲醇终浓度为1.0％、PMSF终浓度为0.5 mM、诱导4d为最佳表达条件，表达量可达约25 μg /ml。经HisTrap? HP亲和层析纯化后，融合蛋白纯度高达90％，回收率约为50％。
⑤生物功能评价：
1.体外实验：琼脂孔扩散法表明，融合蛋白具有一定的抑制和杀伤革兰氏阴性菌的能力；MTT掺入法检测结果融合蛋白对NIH3T3细胞有促增殖活性，当融合蛋白浓度为0.40mg/ml时，促NIH3T3细胞增殖作用最明显，当浓度高于或低于0.40mg/ml时促增殖效果降低。
2.体内实验：造小鼠皮肤浅二度烫伤模型，隔日涂药，以aFGF标准品为阳性对照，以0.9％生理盐水为阴性对照，分别在烫伤后7d、14d、21d 取小鼠受损皮肤作病理切片。结果显示，烫伤后第14d样品组创面已基本愈合，溃疡处毛细血管和成纤维细胞远比阴性对照组密集，与aFGF标准品作用相当；样品组比阴性对照组提前2d～3d 愈合。
结论：
本实验成功构建了分泌型酵母重组表达载体pPICZαA-BPI23-haFGF，筛选出稳定的工程菌X-33/pPICZαA-BPI23-haFGF，并成功表达了目的蛋白BPI23-haFGF，体外实验验证融合蛋白具有杀菌和促细胞增殖的双重功能，体内实验表明融合蛋白能促进毛细血管生成和成纤维细胞分裂，改善创面愈合，为BPI23-haFGF在临床上的应用奠定了基础。