克鲁弗酵母菌富集神经酰胺及其作用研究

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神经酰胺是一种广泛存在于真核生物细胞中的脂类物质。目前关于神经酰胺的研究大多数集中在植物和哺乳动物中,而极少从微生物发酵角度去考察神经酰胺的生产可行性。本论文以四株克鲁弗酵母菌作为试验菌株,采用稀释涂布平板计数法确定了最适克鲁弗酵母菌生长的培养条件,并对四株克鲁弗酵母菌总脂质,极性、中性脂质以及神经酰胺含量进行比较分析,筛选得到了神经酰胺含量最高的克鲁弗酵母菌。进一步研究了环境条件和培养基组分对克鲁弗酵母富集神经酰胺的影响,在此基础上,结合薄层色谱法(TLC)、高相液相色谱法(HPLC)、硅胶柱层层析法及气相色谱-质谱联用法(GC-MS)鉴定了其中神经酰胺单体化合物的分子结构。主要结果如下:(1)通过对四株克鲁弗酵母菌培养条件的研究,确定了最适克鲁弗酵母菌生长的培养条件;在同等培养条件下利用四株克鲁弗酵母进行发酵培养,对其总脂质,极性、中性脂质,神经酰胺含量进行比较分析。结果表明,温度28℃、时间72 h、接种量10.0%、装液量100 m L/250 m L为发酵培养四株克鲁弗酵母菌的最适培养条件,发酵培养后编号为10955菌株总脂质含量最高,而编号为1892菌株总脂质含量最低;四株克鲁弗酵母菌总脂质构成中,中性脂质含量所占的比例略高于极性脂质,其中,编号为1892菌株中性脂质含量显著高于其他三株菌,编号为10955菌株极性脂质含量显著高于其他三株菌;薄层色谱层析显示极性脂质中含有神经酰胺(CM)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、甘油三酯(TG)等功能性成分,且神经酰胺的含量为:10955菌株>10847菌株>1685菌株>1892菌株,其中10955菌株中的神经酰胺含量最高,达到0.39 mg/g。(2)为提高克鲁弗酵母菌生产神经酰胺的水平,研究了培养时间、培养温度、不同浓度甜菜糖蜜、不同浓度蛋白胨、不同浓度乙醇等因素对富集神经酰胺的影响。结果表明,在5种影响因素中,提高甜菜糖蜜浓度(8.0%)和乙醇浓度(12.0%)能够有效增加细胞内神经酰胺的含量,在这条件下其神经酰胺含量同对照组相比分别提高1.8倍及1.6倍。(3)在硅胶层析柱上利用氯仿/甲醇体系为洗脱剂,以梯度洗脱法得到了较纯的神经酰胺类组分,并利用薄层色谱法、高相液相色谱法及气相色谱-质谱联用法对其神经酰胺类组分进行定性定量分析。结果表明,在氯仿、氯仿/甲醇(90:10,v/v)、(80:20,v/v)、(70:30,v/v)、(50:50,v/v)及甲醇洗脱液比例中,在氯仿/甲醇(50:50,v/v)的混合溶剂中能够分离得到较高纯度的神经酰胺类物质,并鉴定得分子式为C44H89NO5,名称为2羟基-N-(1,3,4-三羟基十九烷-2-基)十五烷酰胺的神经酰胺类化合物。这一结果为今后克鲁弗酵母菌作为提取和开发生产神经酰胺类物质新的来源奠定了基础。
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