研究目的：在全球范围内,肺癌是男性癌症死亡的首要原因,是女性癌症死亡的第二原因。近些年来,肺癌发病率和死亡率的增长十分迅速,其中非小细胞肺癌占肺癌总数的85%左右,它主要包括肺鳞癌,肺腺癌,大细胞肺癌。虽然疾病的诊断和治疗都在不断进步。但是非小细胞肺癌的五年生存率仍然很低；而癌基因和抑癌基因的发现与研究对肿瘤的诊断和治疗有着很大的帮助,因此寻找非小细胞肺癌中发挥重要作用的基因,并研究其作用机制就有着深远的意义。TIPE3是最新发现的TNFAIP8家族成员之一,美国宾夕法尼亚大学陈有海教授和我们实验室的合作在国际上首先发现TIPE3是一个促癌分子,可以作为磷酸肌醇的转运蛋白促进肿瘤细胞的生长。TIPE3在人和小鼠中表达的器官近乎相同,且优先表达于上皮来源且有分泌功能的细胞。在大多数肿瘤细胞系中,TIPE3都高表达。小鼠TIPE3的N-端结构域(NT-domain)对于其维持细胞的生长和存活至关重要。在结构上,TIPE3的晶体结构显示其由7个α螺旋(α0-α6)组成,α1-α 6螺旋构成一个疏水性的孔洞,与磷酸肌醇的结合有关,目前在通路方面的研究主要是TIPE3可以激活PI3K-AKT和MEK-ERK通路。TIPE3可以通过TH结构域与脂质结合,包括4,5-二磷酸肌醇和3,4,5-三磷酸肌醇等。我们实验室在前期研究中发现,TIPE3在非小细胞肺癌患者中表达部位分细胞膜型表达和细胞浆型表达两种,且TIPE3在细胞膜上的表达与肺癌高TNM分期有关,细胞浆表达与TNM分期关系不明显。提示TIPE3的膜型表达促进肺癌的进展。而目前在人类肺癌模型中TIPE3的功能和具体机制尚未报道,这也是本文的研究目的。为了明确TIPE3在非小细胞肺癌的作用,阐述其作用机制,本文拟从以下几个方面进行研究：一、在体内和体外检测TIPE3对于非小细胞肺癌生长和迁移的作用。二、明确TIPE3的亚细胞定位与其功能之间的关系。三、对非小细胞肺癌TIPE3分子机制进行初步探索。研究方法：一.在体内和体外检测TIPE3对于非小细胞肺癌生长和迁移的作用。1. RT-PCR和Western blot检测A549和H1975细胞系的内源性TIPE3表达情况。2.H1975细胞系沉默TIPE3, CCK8的方法检测细胞的增殖能力；Transwell小室的方法检测细胞迁移能力。3.A549细胞转染TIPE3重组慢病毒载体,并检验其转染效率。细胞过表达后用CCK8方法检测细胞增殖,用Transwell小室的方法检测细胞迁移。并且在已经转染TIPE3重组慢病毒载体的A549细胞中再进行TIPE3的沉默,检测其迁移能力的变化。4.A549和H1975细胞系转染TIPE3重组质粒,CCK8的方法检测细胞增殖,Transwell小室的方法检测细胞迁移能力的变化。5.体外培养的已转染TIPE3重组慢病毒载体的A549细胞,将其接种于裸鼠皮下,检测肿瘤的大小,并绘制生长曲线；处死裸鼠取瘤检测瘤重,瘤体积。二.明确TIPE3的亚细胞定位与其功能之间的关系。1.免疫荧光的方法检测H1975和A549细胞系内源性TIPE3的表达。观察不同状态的细胞中TIPE3亚细胞定位有何不同。2.在A549细胞系中,免疫荧光的方法检测过表达TIPE3重组慢病毒载体后TIPE3的亚细胞定位,并比较其与功能之间的关系。3.在A549细胞系中,免疫荧光的方法检测过表达TIPE3重组质粒后TIPE3的亚细胞定位,并比较其与功能之间的关系。4.裸鼠皮下成瘤的瘤体制备石蜡切片,进行免疫组织化学染色,观察体内TIPE3的亚细胞定位,并比较其与功能之间的关系。三.非小细胞肺癌TIPE3功能的分子机制1. Western blot检测转染TTPE3重组质粒的A549细胞PI3K-AKT和MEK-ERK通路的变化。2. Western blot检测转染TIPE3重组慢病毒载体的A549细胞PI3K-AKT和MEK-ERK通路的变化。3.在已经转染TIPE3重组慢病毒载体中A549细胞中沉默TIPE3,检测PI3K-AKT和MEK-ERK通路变化。4.在转染TIPE3重组慢病毒载体的A549细胞中,检测Racl的活性。结果：1.TIPE3在细胞浆和细胞膜上均可表达,在活力较高的细胞中主要集中于细胞膜上我们首先用RT-PCR和Western blot的方法检测A549和H1975细胞系内源性TIPE3的表达,发现在基因水平和蛋白水平上,TIPE3高表达于H1975细胞系,低表达于A549细胞系。用免疫荧光的方法验证其内源性TIPE3的表达,结果与RT-PCR和Western blotting的结果一致,H1975细胞系中TIPE3普遍表达较高,而A549细胞系中大部分细胞表达较低。值得注意的是,TIPE3在细胞浆和细胞膜上均可表达,但在H1975细胞中,TIPE3高表达于细胞伪足较多较长的活力较高的细胞的细胞膜上；A549细胞中,TIPE3虽然普遍表达较低,但高表达TIPE3的细胞中主要为活力较高的多伪足细胞,且TIPE3的细胞膜表达明显。2.细胞浆中高表达的TIPE3抑制肺癌细胞的生长和迁移为了探索TIPE3对非小细胞肺癌生长和迁移的影响,我们分别构建了N-末端带有flag标签的长型和短型TIPE3重组质粒载体,并分别转染A549和H1975细胞,用CCK8和transwell小室的方法分别检测其对两种细胞的生长和迁移能力的影响,结果发现外源性的两种TIPE3在A549和H1975细胞中均明显抑制肿瘤细胞的生长和迁移。进一步,我们用免疫荧光的方法检测TIPE3的亚细胞定位,结果发现外源性TIPE3位于细胞浆,即使在生长旺盛的细胞中,也极少检测到TIPE3在膜上的表达。提示TIPE3在细胞浆中的表达可能与抑制肿瘤的生长和迁移有关。3.细胞膜表达TIPE3具有促进肺癌细胞生长和迁移的作用(1)内源性TIPE3促进非小细胞肺癌的生长和迁移为了进一步确定TIPE3对非小细胞肺癌生长和迁移的影响,我们使用特异性的TIPE3小干扰RNA,在H1975细胞系中沉默内源性TIPE3,通过CCK8方法和transwell小室的方法分别检测了其对细胞生长和迁移的影响,结果发现TIPE3的沉默表达有效抑制了肿瘤细胞的生长和迁移。说明内源性的TIPE3可以促进肺癌细胞系的生长和迁移。(2)稳定表达的外源性TIPE3进肿瘤细胞的生长和迁移我们构建了C-末端带有3Flag标签的TIPE3全长重组慢病毒载体,并用包装的慢病毒转染A549细胞。CCK8和transwell小室的实验结果发现,外源性TIPE3可明显促进A549细胞的生长和迁移能力。为了进一步确定其作用,我们在高表达TIPE3的A549细胞系中,再进行沉默TIPE3,结果显示,A549细胞的迁移能力降低;以上结果说明稳定表达的TIPE3促进细胞的生长和迁移(3)稳定表达的外源TIPE3主要定位于细胞膜免疫荧光结果发现过表达的TIPE3大部分以点状聚集的形式定位于细胞膜上,说明TIPE3在细胞膜上的高表达与促进肿瘤的生长和迁移有关。4.细胞膜上高表达的外源性TIPE3在移植瘤小鼠体内可明显促进肺癌细胞的生长为了进一步在体内确定TIPE3的功能,我们将稳定表达外源性TIPE3的A549细胞接种于裸鼠皮下,进行皮下成瘤实验。结果发现,在稳定表达TIPE3的A549细胞中,肿瘤的生长速度明显快于对照组,同时肿瘤的体积和重量也更大。同时,免疫组织细胞化学染色显示,在瘤内TIPE3仍然可高表达于细胞膜上。进一步证明在体内TIPE3在细胞膜上的高表达具有促进肿瘤细胞的生长的作用。5.细胞膜上表达的TIPE3具有促进PI3K-AKT和MEK-ERK通路的活化作用,而细胞浆表达的TIPE3具有抑制作用为了探讨TIPE3在细胞浆和细胞膜表达部位的不同导致其功能不同的机制,我们用Western blot的方法,探讨了其信号通路的差异。结果显示膜表达的TIPE3可明显促进PI3K-AKT和MEK-ERK通路的活化,表现为TIPE3在膜上的过表达引起p-AKT和p-ERK的表达水平上调；沉默TIPE3后,p-AKT和p-ERK的表达水平降低。然而,在细胞浆表达的TIPE3则抑制AKT和ERK信号通路的活化,表现为p-AKT和p-ERK下调。说明T1PE3依赖AKT和ERK通路发挥作用,膜上表达的TIPE3具有促进PI3K-AKT和MEK-ERK通路的活化作用,而细胞浆表达的TIPE3具有抑制作用。我们还发现在A549细胞中,膜表达的TIPE3可以促进Racl的活性,从而可能通过活化的Racl促进细胞的生长和迁移,是TIPE3发挥其促癌作用的另一机制。结论1. TIPE3的功能与其亚细胞定位有关：细胞膜定位的TIPE3可以促进细胞的生长和迁移的能力,细胞浆定位的TIPE3抑制细胞生长和迁移。2.细胞膜上表达的TIPE3具有促进PI3K-AKT和MEK-ERK通路的活化作用,而细胞浆表达的TIPE3具有抑制作用创新性和意义1.首先发现人TIPE3的功能与其亚细胞定位有关,这为进一步研究TIPE3在肿瘤中的作用和以TIPE3为靶点进行肿瘤的干预治疗提供了依据。2.发现在膜上表达的TIPE3可通过促进PI3K-AKT和MEK-ERK通路的活化促进肺癌细胞的生长和迁移,在胞浆表达的TIPE3则可通过抑制上述通路抑制肿瘤细胞的生长和迁移,为TIPE3作用机制的研究提供了证据。局限性1.对胞浆内TIPE3抑制细胞生长和迁移的确切机制尚未阐述明确。2.本研究主要通过免疫荧光说明定位和功能的关系,尚有一定局限性,需要更多的实验确定这个结论。