哺乳动物细胞质型硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase 1,Trx R1）是一种硒蛋白,对生物体胞内氧化还原平衡发挥重要作用,与肿瘤、炎症等疾病的发生发展密切相关。深刻认识Trx R1性质和功能,高度依赖于获得高品质TrxR1。目前,哺乳动物硒蛋白的表达和纯化,存在收率低、活力弱等问题,因此,本研究专注于TrxR1的原核表达过程和高效分离纯化策略,主要开展以下三方面工作:1.原核表达过程的优化:通过向生长培养基添加核黄素前体维生素B2（riboflavin）或添加二价金属离子如Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺等,用于提高Trx R1的原核表达。发现riboflavin在0-1000μM的浓度范围内可以促进Trx R1的表达,当riboflavin的浓度为10μM时,酶体积活力提高了60%。Mg²⁺在0-300μM的浓度范围内可以促进TrxR1的表达,当Mg²⁺的浓度为200μM时,酶体积活力提高189%。Mn²⁺在0-200μM的浓度范围内可以促进Trx R1的表达,当Mn²⁺的浓度为100μM时,酶体积活力提高26%。Ca²⁺在0-1000μM的浓度范围内可以促进Trx R1的表达,当Ca²⁺的浓度为400μM时,酶体积活力提高44%。2.分离纯化策略的改进:建立了亲和层析与凝胶过滤联用的策略分离纯化Trx R1,取得了极佳的分离效果。在ADP Sepharose亲和层析阶段,通过向TrxR1粗酶中补充乙二胺四乙酸（EDTA）等螯合剂进行样品预处理,保护了亲和层析基质上的ADP配基,大幅度提高Trx R1的亲和层析收率。EDTA的浓度为20 mM时,收率提高了约33%,亲和层析柱效稳定、重现性优秀。在凝胶过滤阶段,用高性价比的Sephacryl S-300代替Superdex G-200凝胶过滤柱,极大降低了成本。达到了约72%的TrxR1最终收率,SDS-PAGE电泳结果显示单一条带,纯化效果好。3.Trx R1性质的表征:探究不同重金属离子对酶活性的影响,发现很多金属离子(如Hg²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Fe³⁺等)对Trx R1的DTNB还原活性存在浓度依赖的抑制作用,随着金属离子浓度的升高,酶的DTNB还原活性快速降低。使用EDTA螯合粗酶液里的痕量重金属离子,在纯化过程中极大的解除了抑制作用。综上,本研究结果优化了TrxR1的原核表达,改进了TrxR1的分离纯化策略,表征了重金属离子对Trx R1的抑制作用,为制备高品质Trx R1奠定了基础,为研究TrxR1的功能性质提供帮助,也为其他硒蛋白的表达和纯化提供了参考。