猕猴桃拟茎点霉属感染的表面增强拉曼光谱早期预警研究

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猕猴桃软腐病是猕猴桃果实在贮藏期间发生的主要病害,它会加速猕猴桃的腐烂从而导致相当大的经济损失。拟茎点霉属是引起猕猴桃软腐病主要病原菌之一,对其进行早期预警及防控对猕猴桃产业价值及经济发展有重要意义。目前检测猕猴桃中拟茎点霉属的研究相对较少,已有的聚合酶链式反应(PCR)仍存在灵敏度较低无法实现早期预警的缺点。表面增强拉曼光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)具有灵敏度高、荧光背景低、前处理简单、快速等优点,在食品安全检测领域已有广泛应用。因此,本文提出一种针对拟茎点霉属的SERS检测方法实现对处于感染早期的果实的高灵敏检测。具体研究内容如下:(1)利用盐老化法将两条针对拟茎点霉属的特异性引物接到金纳米颗粒上形成纳米探针,通过紫外-可见光谱、zeta电位及水合粒径对纳米探针进行表征。(2)引入helper DNA调节纳米探针上引物的修饰密度,利用暗场显微镜优化helper DNA与引物的浓度比例。单个纳米探针、纳米探针小聚集体、大聚集体在暗场显微镜下分别显示为绿色、黄色和红色的点,利用RGBto HSI算法对暗场图像中的点进行判断、统计,选择1:4为最合适的引物/helper DNA比例。(3)利用上述纳米探针对拟茎点霉菌基因组DNA中的片段进行检测,报告分子在1326cm-1处的SERS信号与DNA浓度对数之间存在良好的线性关系,线性检测范围为1p M-100p M;此外,1326cm-1处的相对标准偏差为10.32%,SERS检测重现性良好。(4)利用纳米探针对发病果实中分离培养的18种病原菌进行检测,结果表明纳米探针对拟茎点霉属的特异性;对基因组DNA的线性检测范围为0.005ng/μL-5ng/μL,最低可检测到0.005 ng/μL的基因组DNA。此外,对感染拟茎点霉菌后不同时间点的果实样品进行SERS检测,结果显示患病24小时的样品SERS信号已有显著增强,表明本文提出的SERS检测方法在拟茎点霉菌引起的软腐病的早期预警方面的应用潜力。
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