新城疫是由新城疫病毒感染引起的一种高致病性的家禽病毒性疾病。因为新城疫具有较高的感染率和致死率,且在全球范围内都可以传播,所以威胁到全球养禽业。新城疫病毒感染禽类能激活宿主天然免疫反应,引起大量炎性因子表达,形成炎症因子风暴,而不同毒株NDV感染后诱导细胞因子表达的水平存在差异。在被强毒NDV感染的禽类体内,其呼吸道和消化道黏膜等会产生出血等渗出性炎症病理现象。作为一种晚期炎症因子,由感染引起、被主动释放至细胞外的高迁移率组蛋白B(High mobility group box-1,HMGB1)具有促炎因子样作用,是一种重要的炎症调控因子,关于鸡HMGB1蛋白的功能研究鲜有报道,鸡HMGB1蛋白在新城疫病毒引起炎症反应中所发挥的作用值得研究。为了更好的控制临床上新城疫病毒感染引起的炎症反应,降低由炎症导致的感染禽类死亡提供理论指导,我们进行了以下的研究。(1)本研究通过从CEF细胞和HeLa细胞中扩增出鸡HMGB1和人HMGB1基因序列,并将鸡HMGB1和人HMGB1蛋白序列进行比对,发现两者在A盒和B盒区域相似性较高,在羧基端有较大差异。通过构建pEGFP-N1-chHMGB1重组表达质粒,转染至HeLa细胞后发现鸡HMGB1定位于细胞核区域。通过半定量RT-PCR实验,对成年SFP鸡各组织脏器中HMGB1含量进行分析,发现鸡HMGB1蛋白广泛分布于鸡体的各种组织中,其中法氏囊和肠道丰度较高,而肌肉和内脏器官丰度相对较低。(2)本研究通过构建pET-28a-chHMGB1原核表达载体,原核表达鸡HMGB1重组蛋白,并免疫小鼠,五次免疫后取小鼠全血制备多克隆抗体,再通过融合免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞,经四次亚克隆后,获得三株针对重组鸡HMGB1蛋白的单克隆抗体。经过实验验证,所制备的多克隆抗体和三株单克隆抗体均具有ELISA、Western Blot和IFA效价。对多克隆和单克隆抗体的细胞特异性检测,发现该多克隆抗体特异性针对鸡HMGB1蛋白,而三株单克隆抗体具有通用性,可以识别鸡,人,鼠,猴,猪五种细胞中的HMGB1蛋白。该单克隆抗体也可以中和HMGB1诱导的炎症因子表达上调。该单抗的成功研制将为进一步研究鸡HMGB1蛋白功能以及其在新城疫病毒感染过程中多发挥作用提供必须的生物学试剂。(3)本研究对新城疫病毒感染细胞后对细胞内HMGB1蛋白影响进行了分析,我们使用Herts/33毒株感染DF1细胞和A549细胞后通过间接免疫荧光实验证明新城疫病毒感染可以导致原本定位于细胞核内的HMGB1蛋白重新定位于胞质区域。同时我们又通过Western Blot实验和荧光定量PCR实验验证1MOI Herts/33感染DF1和A549细胞后,并不诱导细胞内HMGB1蛋白的表达量发生明显变化。我们同时使用强毒株Herts/33和弱毒株La Sota感染A549细胞后,通过ELISA检测试剂盒可以检测到病毒感染后上清中HMGB1蛋白水平逐渐增加。这一结果说明新城疫病毒感染细胞并不直接诱导HMGB1蛋白表达量发生明显变化而是诱导原本定位于细胞核内的HMGB1蛋白逐步迁移至胞质区域,进而又释放至细胞外环境。并且当使用不同剂量Herts/33毒株感染细胞后,发现这种病毒感染后诱导HMGB1蛋白释放作用具有感染剂量依赖关系。(4)本研究继续对HMGB1蛋白对新城疫病毒在细胞内复制的影响进行了分析。我们首先将构建的FLAG-chHMGB1和FLAG-huHMGB1真核质粒转染至DF1和A549细胞中并感染Herts/33毒株,结果显示过表达HMGB1蛋白并不能影响新城疫病毒在细胞内的复制。同样通过外源加入HMGB1蛋白刺激后感染Herts/33病毒,结果显示外源加入该蛋白也不影响NDV在细胞内的复制。为了充分验证这一点,我们又使用两种HMGB1抑制剂,丙酮酸乙酯和甘草酸和自己制备的chHMGB1中和抗体。在1MOI Herts/33病毒感染细胞后分别使用这两种抑制剂或者chHMGB1中和抗体,结果显示使用两种不同类型的抑制剂或者chHMGB1中和抗体都不能抑制新城疫病毒在细胞中的复制。以上结果都说明HMGB1蛋白并不影响新城疫病毒在细胞中复制。(5)最后本研究分析了HMGB1蛋白对新城疫病毒激活NF-κB信号通路和诱导炎症因子上调的影响。首先我们通过荧光定量PCR实验和ELISA检测证明新城疫病毒强毒株Herts/33和弱毒株La Sota都可以诱导细胞内炎症因子IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-αmRNA水平上调,以及分泌至细胞上清中,并且分泌至上清中的炎症因子水平具有感染剂量依赖作用。1MOI Herts/33病毒感染细胞后,NF-κB信号通路被激活。以上实验证明,新城疫病毒感染细胞可以通过激活NF-κB信号通路而诱导下游炎症因子mRNA水平上调并分泌至细胞上清中。我们在新城疫病毒感染12h后加入HMGB1蛋白,发现外源加入HMGB1可以促进新城疫病毒激活NF-κB信号通路,以及诱导下游炎症因子mRNA水平上调。当干扰HMGB1后可以抑制NDV激活NF-κB信号通路。我们又在病毒感染后使用HMGB1的两种抑制剂和chHGMB1中和抗体,结果显示HMGB1抑制剂和chHGMB1中和抗体可以抑制新城疫病毒诱导的炎症因子mRNA水平上调。我们又研究了在这一过程中参与其中的受体蛋白,通过干扰TLR3,RAGE和TLR4受体蛋白后检测炎症因子mRNA水平,结果显示干扰RAGE受体和TLR4受体后,新城疫病毒诱导炎症因子上调作用受到抑制。中和抗体体内实验表明用chHMGB1中和抗体可以通过中和鸡HMGB1蛋白的促炎因子样作用而延缓由新城疫病毒感染引起的死亡。以上结果最终证明,新城疫病毒感染诱导HMGB1蛋白从细胞核迁移至胞质区域继而释放至上清中,释放至上清中的HMGB1蛋白对新城疫病毒在细胞内复制本身无明显影响,而是通过与RAGE受体和TLR4受体作用进而参与新城疫病毒激活NF-κB信号通路和诱导下游炎症因子表达量上调,加速了炎症因子风暴的形成。