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旋毛虫(Trichinella spiralis)是一种典型的人兽共患寄生线虫,其引发的旋毛虫病是一种世界广泛分布的食源性寄生虫病。目前的诊断方法主要为集样消化法和ELISA检测方法。肌幼虫排泄分泌产物(ES)为应用最广泛的诊断抗原,但具有期特异性且成分复杂。旋毛虫相关蛋白可引发宿主Th2型免疫反应,造成宿主的免疫抑制,进而形成慢性感染导致长期寄生,现阶段该反应机理尚不清楚。旋毛虫ES成分复杂,包含多种蛋白酶:丝氨酸蛋白酶、谷胱甘肽转移酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等。因此,旋毛虫ES相关抗原分子的分离、鉴定及其抗原性和免疫调节性的研究对于旋毛虫病免疫学检测方法的建立及疫苗研制非常重要。本实验室前期构建了旋毛虫3日龄成虫的c DNA文库,经过免疫学方法筛选得到高丰度与强免疫反应性的丝氨酸蛋白酶基因Ts-Sp-7(Gen Bank登录号EU263332.1)。本研究基于该基因对Ts-Sp-7蛋白抗原性及免疫调节性进行研究。参照Gen Bank公布的Ts-Sp-7基因序列,设计特异性引物,收取感染3天的旋毛虫成虫阶段的总RNA,反转录获取目的序列,常规PCR扩增,并构建原核表达载体p ET28a-Ts-Sp-7,原核表达。SDS-PAGE结果显示,在47 k Da左右呈现一条蛋白条带,与理论值47.5 k Da一致,收获复性纯化后的Ts-Sp-7蛋白。Western-Blot结果显示,该蛋白能够与10000条/头感染剂量不同感染天数(15dpi、30 dpi、45 dpi、60 dpi、90 dpi、120 dpi)的猪阳性血清发生特异性反应。结果可知,纯化后的目的蛋白具备良好的反应原性。其次,采用变性纯化的Ts-Sp-7蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗Ts-Sp-7蛋白兔多克隆抗体。用间接ELISA测得该多抗效价是1:350000。由间接免疫荧光结果可以看出,相对于兔阴性血清对照组,Ts-Sp-7蛋白多抗作为一抗的肌幼虫表皮有很强烈的红色荧光信号。采用变性纯化Ts-Sp-7蛋白免疫BABL/c小鼠,复性纯化的重组Ts-Sp-7蛋白及ES进行筛选,收获稳定分泌抗Ts-Sp-7蛋白抗体的杂交瘤细胞株。经过3次亚克隆,收获了5株杂交瘤细胞株,可以稳定地分泌抗Ts-Sp-7蛋白抗体。竞争ELISA结果显示,猪阳性血清能够抑制其中两株单抗与重组Ts-Sp-7的结合,命名为H4H7-2A4、H8D12-5B9。Western-Blot结果显示纯化后的两株单抗均能特异性地识别虫体蛋白。亚型鉴定显示,H4H7-2A4抗体为Ig G2a亚类,κ亚型;H8D12-5B9抗体Ig G2b亚类,λ亚型。以Ts-Sp-7基因序列为模板,设计3对引物,对Ts-Sp-7蛋白进行分段截短表达。Western-Blot结果表明,两株单抗都能够特异性地识别Ts-Sp-7-2蛋白。进而利用Pep Scan技术合成8个短肽,进行间接ELISA鉴定。确定H4H7-2A4所识别抗原表位位于W5肽段,氨基酸序列为222 GVDRSATCQGDSGGP236。H8D12-5B9所识别抗原表位位于W7肽段,氨基酸序列为252PPTCGDARHSVKFAKVP268。多克隆抗体和竞争性单克隆抗体的成功制备为建立基于Ts-Sp-7蛋白的旋毛虫感染诊断试剂奠定了基础。从小鼠骨髓源细胞里分离提取到树突状细胞(BMDCs),体外对其诱导分化,形成未成熟状态的BMDCs,设立Ts-Sp-7蛋白单独作用组、LPS阳性对照组以及PBS阴性对照组,分别刺激BMDCs,利用流式细胞术分析目的蛋白对BMDCs成熟活化的影响。结果显示,Ts-Sp-7蛋白可诱导BMDCs表面分子CD86的表达,对MHCⅡ类分子的表达无显著影响,表明Ts-Sp-7蛋白可促进BMDCs的成熟。进而从OVA抗原特异性转基因小鼠(OT-II)脾脏内分离提取到Na?ve CD4+T细胞,和Ts-Sp-7蛋白预先刺激的BMDCs建立共培养体系,在OVA抗原刺激的前提下,检验Na?ve CD4+T细胞活化、增殖和分化的情况。结果表明Ts-Sp-7蛋白可促进Na?ve CD4+T细胞的明显增殖。可促进效应T细胞表面分子CD44和CD62L的表达,促进效应T细胞活化为可以参与淋巴细胞再循环的效应T细胞。Ts-Sp-7蛋白孵育的BMDCs可诱导Na?ve CD4+T细胞向Treg型分化,推测TsSp-7蛋白是具有免疫调节性的重组蛋白,可能参与宿主免疫调控。综合以上实验结果,Ts-Sp-7蛋白具备良好的抗原性及免疫调节性,可作为旋毛虫的诊断抗原及调控分子,在旋毛虫诊断方法的建立及宿主免疫反应的调节过程中发挥重要功能。