背景与目的结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是常见的胃肠道恶性肿瘤之一,在全球的发病率和死亡率均较高,我国结直肠癌的发病率也逐年上升。中晚期结直肠癌患者的临床治疗方案主要以化疗或术后辅助性化疗为主,但目前部分结直肠癌患者对化疗方案出现耐药现象,而且化疗会给患者造成不良反应。减少化疗药物的毒副作用,改善患者生活质量是目前迫切需要解决的问题。小分子化合物可靶向作用于肿瘤细胞中的特定蛋白,精准作用于癌细胞,抑制癌细胞增殖,减少对机体正常细胞的损伤。因此阐明小分子化合物抑制结直肠癌的作用机制,可为结直肠癌患者提供科学、低毒、高效的治疗策略。紫草(Lithospermum erythrorhizon)是我国传统的中草药,具有抗菌、消炎、抗肿瘤等作用,其有效成分主要分布于根部。紫草根中含有紫草素、异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β,β-二甲基丙烯酰紫草素等萘醌类小分子化合物。本实验室利用自主研发的紫草根提取法从该植物中分离获得了β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素两种小分子化合物,紫草根提取步骤第一步获得了β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素两者的混合物(质量比为2:1)。有研究表明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素具有抗肿瘤的作用,但β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素对结直肠癌的抑制机制尚不明确。本研究发现紫草根有效成分β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素均可抑制结直肠癌细胞(HCT 116、HCT-15、SW 620和DLD-1)的增殖,诱导细胞周期阻滞在G0/G1期,诱导细胞凋亡。计算机模拟技术显示β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素可分别与成纤维细胞生长因子受体1(Fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)和 T-LAK 细胞源蛋白激酶(T-LAK cell-originated protein kinase,TOPK)竞争性的结合在疏水性的ATP“口袋”区域,并通过体外激酶实验、蛋白下拉实验、基因沉默实验进一步证实β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁可与激酶FGFR1结合,乙酰紫草素可与TOPK结合并抑制其活性,下调FGFR1和TOPK信号通路中相关蛋白的磷酸化水平,进而抑制结直肠癌的发展。此外本研究发现FGFR1在结肠癌中发挥促癌基因的作用。FGFR1和TOPK均可调控细胞增殖、分化和迁移,在癌症的发生发展中发挥着重要作用。体内实验表明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素可分别抑制FGFR1或TOPK阳性表达的人源异种移植瘤(Patient-derived xenograft,PDX)小鼠模型中肿瘤的生长,β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素两者混合物可在体内外联合抑制结直肠癌的增殖。该研究揭示了紫草根提取物β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素在体内外对结直肠癌的抑制作用,并阐明了两种小分子化合物对结直肠癌的调控机制,为紫草根抗癌药物的研发提供理论依据。方法1.利用细胞毒性实验检测紫草根有效成分β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素对人正常结肠成纤维细胞CCD-18Co活力的影响,选取适宜的浓度进行后续实验。2.利用细胞增殖实验检测β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁、乙酰紫草素及两者混合物对结直肠癌细胞增殖的影响。3.利用软琼脂克隆形成实验检测β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁、乙酰紫草素及两者混合物对结直肠癌细胞锚定非依赖生长的抑制作用。4.利用流式细胞分析仪检测β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁、乙酰紫草素及两者混合物对结直肠癌细胞周期和凋亡的影响。5.利用激酶谱实验、超级计算机模拟β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁、乙酰紫草素与靶标蛋白的相互作用。6.以人正常结肠成纤维细胞CCD-18Co作为对照,免疫印迹检测结直肠癌细胞中FGFR1和TOPK蛋白的磷酸化水平。7.以结直肠癌癌旁正常组织作为对照,利用免疫组化法检测人结直肠癌组织中FGFR1的磷酸化水平及总蛋白表达情况。8.利用体外激酶实验分别检测β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素对FGFR1和TOPK激酶活性的影响。9.利用蛋白下拉实验分别检测β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁与FGFR1,乙酰紫草素与TOPK的相互作用。10.利用ATP竞争性结合实验及酶代动力学实验检测乙酰紫草素与TOPK之间的结合形式。11.利用shRNA基因沉默实验检测分别下调FGFR1或TOPK对结直肠癌细胞的增殖及锚定非依赖生长的影响。12.利用软琼脂克隆实验检测β,β-二.甲基丙烯酰阿卡宁或乙酰紫草素对下调FGFR1或TOPK的结直肠癌细胞锚定非依赖生长的影响。13.利用免疫印迹实验分别检测β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁或乙酰紫草素对FGFR1或TOPK下游信号通路的影响。14.利用双荧光素酶报告基因实验检测乙酰紫草素对NF-κB转录活性的影响。15.利用shRNA基因沉默实验检测同时下调FGFR1和TOPK对结直肠癌细胞的增殖及锚定非依赖生长的影响。16.联合给予结直肠癌细胞FGFR抑制剂(AZD4547)和TOPK抑制剂(HI-TOPK-032)处理,利用细胞增殖实验检测结直肠癌细胞增殖情况。17.联合给予结直肠癌细胞β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素处理,利用细胞增殖实验检测结直肠癌细胞增殖情况。18.利用免疫印迹方法检测不同结直肠患者肿瘤样品中FGFR1及TOPK的表达情况,选取表达水平较高的组织样品构建PDX小鼠模型并进行后续实验。19.构建结直肠癌人源异种移植瘤小鼠PDX模型,以灌胃的方式给予小鼠β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁、乙酰紫草素或两者混合物药物处理,检测紫草根有效成分在体内对结直肠癌生长的抑制作用。20.利用免疫组化实验检测经β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁或乙酰紫草素处理的小鼠肿瘤组织中Ki-67、FGFR1或TOPK信号通路相关蛋白的磷酸化情况。结果1.β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素对人正常结肠成纤维细胞CCD-18Co无明显毒性作用细胞毒性实验表明,浓度在10μM以内的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素对人正常结肠成纤维细胞CCD-18Co的活力无明显抑制作用,因此选取10μM以内浓度进行后续研究。2.紫草根有效成分能够显著抑制结直肠癌细胞的增殖细胞增殖实验表明:1.25、2.5、5和10μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁,2.5、5和10 μM的乙酰紫草素,0.38、0.75和1.5 μg/μL的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素混合物均能够显著抑制结直肠癌细胞HCT 116、HCT-15、SW620和DLD-1的增殖,且对结直肠癌细胞增殖的抑制作用呈时间-剂量依赖性。3.β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素能够显著抑制结直肠癌细胞的锚定非依赖生长软琼脂克隆形成实验表明,β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素两者均能抑制结直肠癌细胞的锚定非依赖生长,且呈剂量依赖性。4.紫草根有效成分能够诱导结直肠癌细胞周期阻滞在G0/G1期及细胞凋亡流式细胞仪检测细胞周期表明:5和10μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素,0.38、0.75和1.5 μg/μL的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素混合物均可将结直肠癌细胞的生长周期阻滞在G0/G1期;免疫印迹结果表明:浓度为5和10 μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁或乙酰紫草素可下调细胞周期G0/G1期相关蛋白cyclinD1和cyclinD3的表达;细胞凋亡表明:5和10 μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁、乙酰紫草素,0.38、0.75和1.5 μg/μL的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素混合物能够诱导结直肠癌细胞凋亡;免疫印迹结果表明:浓度为5和10μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素可下调细胞凋亡标志物PARP、caspase-3和caspase-7的表达,上调细胞凋亡标志物p21、cleaved PARP、cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-7 的表达。5.利用激酶谱实验及计算机模拟实验预测紫草根有效成分β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素的靶标蛋白利用激酶谱实验检测β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁对50种激酶活性的影响,结果表明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁对FGFR1活性的抑制作用为66%,计算机模拟实验表明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁与FGFR1蛋白的ATP结合区域相结合,能与该区域形成复合物,且结合位点为Glu531、Val559、Ala564和Asp641;乙酰紫草素与TOPK蛋白的ATP结合“口袋”存在相互作用,能与该区域形成复合物,且结合位点为Lys64、Gly118和Asn172。6.与人正常结肠成纤维细胞CCD-18Co相比,结直肠癌细胞中FGFR1蛋白及磷酸化水平,TOPK蛋白及磷酸化水平在结肠癌细胞系中表达较高免疫印迹结果表明:与人正常结肠成纤维细胞CCD-18Co相比,p-FGFR1和 FGFR1 在结直肠癌细胞 HCT-15、HCT 116、DLD-1、SW 620 和 HT-29 中均高表达;pTOPK和TOPK在结直肠癌细胞HCT-15、HCT 116、DLD-1和SW 620中高表达。7.通过与结直肠癌癌旁正常组织进行对比,p-FGFR1和FGFR1在人结直肠癌组织中高表达免疫组化染色结果表明:p-FGFR1和FGFR1在结直肠癌组织中的表达水平显著高于结直肠癌癌旁正常组织,并且p-FGFR1和FGFR1在结直肠癌组织中表达差异具有统计学意义(p<0.05)。8.紫草根有效成分β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素能够分别抑制激酶FGFR1和TOPK的活性体外激酶实验表明0.6和1.25 μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁能够显著抑制激酶FGFR1的活性。0.6、1.25和2.5μM的乙酰紫草素能够显著抑制底物c-Jun的磷酸化情况,即抑制激酶TOPK的活性,乙酰紫草素对激酶TOPK活性的抑制作用呈浓度依赖性(p<0.05)。9.蛋白下拉实验表明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素可分别与FGFR1或TOPK蛋白相互作用,形成复合物。10.ATP竞争性结合及酶促动力学实验表明乙酰紫草素与TOPK以ATP竞争性的形式结合ATP竞争性结合实验表明:随着ATP浓度升高,乙酰紫草素与TOPK之间的结合能力逐渐下调。酶促动力学结果表明:0.3 μM的乙酰紫草素处理TOPK后,与对照组相比,激酶TOPK的Km值由15升至20,说明乙酰紫草素可降低底物与激酶TOPK的亲和力。11.shRNA基因沉默实验下调FGFR1或TOPK的表达可抑制结直肠癌细胞的增殖及锚定非依赖生长。12.软琼脂克隆实验表明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁对下调FGFR1表达的结直肠癌细胞锚定非依赖生长无显著抑制作用;乙酰紫草素对下调TOPK表达的结直肠癌细胞锚定非依赖生长无显著抑制作用。13.β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素可分别抑制FGFR1和TOPK下游蛋白的磷酸化水平浓度为5和10μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁处理结直肠癌细胞2 h后,免疫印迹结果表明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁抑制结直肠癌细胞FGFR1信号通路中JAK2,STAT3和MEK1/2的磷酸化水平。浓度为5和10 μM的乙酰紫草素处理结直肠癌细胞8 h后,免疫印迹结果表明乙酰紫草素抑制结直肠癌细胞TOPK信号通路中ERK,RSK和c-Jun的磷酸化水平。14.乙酰紫草素抑制NF-κB的转录活性双荧光素酶报告基因实验表明,与对照组相比,1.25、2.5、5和10 μM的乙酰紫草素能够显著抑制结直肠癌细胞中转录活性因子NF-κB的转录活性,乙酰紫草素对NF-κB转录活性的抑制作用与浓度呈正相关(p<0.05)。15.shRNA基因沉默实验同时下调FGFR1和TOPK的表达可联合抑制结直肠癌细胞的增殖及锚定非依赖生长基因沉默实验分别下调FGFR1、TOPK或同时下调FGFR1和TOPK的表达,均可抑制结直肠细胞HCT 116的增殖及锚定非依赖生长,且同时下调FGFR1和TOPK的表达对HCT 116细胞增殖及克隆形成的抑制作用显著高于单独下调FGFR1或者TOPK的表达(p<0.05)。16.AZD4547和HI-TOPK-032能够联合抑制结直肠癌细胞的增殖细胞增殖实验表明:给予HCT 116细胞5 μM的AZD4547、0.6μM的HI-TOPK-032 或 AZD4547 和 HI-TOPK-032 联合处理 72 h 后,均能抑制 HCT 116细胞的增殖,同时给予AZD4547和HI-TOPK-032对HCT 116细胞增殖的抑制作用显著高于AZD4547和HI-TOPK-032单一处理组(p<0.05)。17.β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素能够联合抑制结直肠癌细胞的增殖细胞增殖实验表明:0.6 μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁,2.5 μM的乙酰紫草素或者两者联合均能抑制结直肠癌细胞DLD-1的增殖,且β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素联合处理组对结直肠癌细胞DLD-1细胞增殖的抑制作用显著高于单一药物处理组(p<0.05)。18.结直肠癌患者肿瘤组织样品中FGFR1和TOPK的表达存在差异免疫印迹结果表明:结直肠癌患者肿瘤组织样品中FGFR1和TOPK表达存在差异,编号HJG101患者组织样品中FGFR1的表达量较高,HJG41样品中TOPK的表达量较高,HJG86患者组织样品中FGFR1和TOPK的表达量均较高,因此分别选取对应肿瘤组织构建结直肠癌人源异种移植瘤小鼠模型并进行后续体内实验。19.紫草根有效成分能够抑制FGFR1、TOPK阳性表达的结直肠癌人源异种移植瘤的生长PDX模型体内实验表明:荷瘤小鼠随着β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁、乙酰紫草素或两者混合物给药时间增长,肿瘤体积及质量明显小于对照组(p<0.05),且β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁或乙酰紫草素处理后,小鼠的体重、肝脏重量、脾脏重量以及白细胞数目未发生显著变化。β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素混合物对肿瘤生长抑制作用的效果优于β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁处理组或乙酰紫草素处理组(p<0.05)。20.紫草根有效成分可在体内抑制肿瘤增殖指标Ki-67的表达,且抑制FGFR1、TOPK下游信号通路的磷酸化水平免疫组化结果表明,与对照组相比,β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁治疗后小鼠肿瘤组织中Ki-67及FGFR1信号通路相关蛋白JAK2、STAT3和MEK1/2的磷酸化水平均显著下调(p<0.05);乙酰紫草素治疗后小鼠肿瘤组织中Ki-67及TOPK信号通路相关蛋白ERK、RSK和c-Jun的磷酸化水平均显著下调(p<0.05)。结论1.紫草根有效成分β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁通过靶向FGFR1,下调p-JAK2、p-STAT3、p-MEK1/2的表达,抑制结直肠癌细胞的增殖,锚定非依赖性生长,诱导细胞周期阻滞在G0/G1期和细胞凋亡,同时抑制FGFR1高表达的结直肠癌人源异种移植瘤生长。2.紫草根有效成分乙酰紫草素通过靶向TOPK,下调pERK、pRSK和pc-Jun的表达,抑制结直肠癌细胞的增殖,锚定非依赖性生长,诱导细胞周期阻滞在G0/G1期和细胞凋亡,抑制TOPK高表达的结直肠癌人源异种移植瘤的生长。3.紫草根有效成分β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素可联合抑制结直肠癌细胞的增殖,诱导细胞周期阻滞在G0/G1期和细胞凋亡,β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素可联合抑制p-FGFR1/FGFR1,p-TOPK/TOPK高表达的结直肠癌人源异种移植瘤的生长。