茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen）,是重庆市涪陵区的特色农业资源，其收获物瘤茎（俗称青菜头）是世界三大名腌菜之一“涪陵榨菜”的主要原料。茎瘤芥营养丰富，加工后形成的榨菜脆嫩爽口、味道独特，深受国内外消费者的喜爱。榨菜业的发展为涪陵地区带来了稳定的经济效益和社会效益。可近年来，由于十字花科根肿病的扩展蔓延，严重影响茎瘤芥的产量，造成巨大的经济损失。根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）侵染所致。鉴于根肿病菌是一种单科单属的活体专性寄生真菌，不能进行体外人工培养，病原菌全基因组未测序，已知功能基因甚少，与其他病原菌的同源性不高，加之抗性材料缺乏，给抗病育种带来较大的影响。培育抗病品种是防治根肿病最有效的途径，抗性品种的选育，需要探明根肿病菌和茎瘤芥之间的分子互作关系，阐明根肿病的致病机理。因此，本论文从芸苔根肿菌和宿主茎瘤芥之间的分子互作入手，发掘茎瘤芥受根肿菌侵染后差异表达基因并研究其潜在的功能，将为阐明根肿病的致病机理、获得抗病相关基因，为病害的防治奠定基础。本研究通过几年研究工作，取得了以下主要成果。1）成功构建茎瘤芥抑制差减杂交文库：基于建立的稳定重复利用的茎瘤芥苗无土快繁种植体系，即采用珍珠岩加MS营养液，在光照培养箱中大量培育茎瘤芥幼苗。茎瘤芥苗两周达到出四叶期，为芸苔根肿菌的致病性接种及病原菌和寄主植物的互作提供了充足试验材料。利用抑制差减杂交文库技术，以人工接种感染芸苔根肿菌的感病植株和健康植株分别作为实验组和驱动组成功构建抑制差减杂交文库。经蓝白斑筛选，菌落PCR验证和斑点杂交，获得224个阳性克隆子。将阳性克隆子测序，得到高质量的EST序列196条，平均长度为332bp。将聚类、拼接的173条EST序列和NCBI的NT、EST数据库进行比对，其中146条(84.4%) EST序列和植物已知序列具有同源性。将聚类、拼接的173条EST序列所编码的蛋白质与NCBI的NR数据库进行比对，其中58条EST序列（33.5%）所编码的蛋白质和已知蛋白基因具有相似性，15条EST序列（8.7%）和假想蛋白基因具有相似性，100条EST序列（57.8%）与已知蛋白的基因没有同源性。利用在线软件对编码的蛋白质功能进行生物信息学分析显示，这些基因编码的蛋白质参与了多种细胞结构和分子过程，如能量代谢(11.11%)、压力反应和防御(5.56%)、运输(5.56%)、转录调控(5.56%)、翻译和生物合成（33.33%）及其他功能(38.91%)。EST序列在线提交NCBI的dbEST数据库，登录号是JK615948-JK616120。2）茎瘤芥SSH文库重要差异基因的筛选验证：采用实时荧光定量PCR分析了正向差减文库中随机挑取的四个基因的在不同时间表达水平。生物信息学分析表明这四个基因JK616040，JK616031， JK615948和JK615982分别是ATP合成酶链基因，40S核糖体蛋白基因，细胞色素b5氧化还原酶基因和热休克转录因子基因。同茎瘤芥健康植株相比，四个基因在罹病植株中均呈现明显的上调表达，证实本文所构建茎瘤芥SSH差减文库可信度高，从中筛选差异表达EST序列准确可靠。3）茎瘤芥重要差异基因的动态表达分析：对文库中的重要EST序列进行生物信息学分析，筛选出与植物防御或者感病响应相关的6类蛋白或受体的编码基因。与健株相比，病株中的乙烯反应转录因子（JK616020）在接种后10天到15天表达下调，而在接种20天以后，病株中的表达量几乎都大于健株。脱落酸受体（JK616120）基因在接种25天以前在病株中的表达量相对健株降低，而在接种后30天和40天在病株中的表达量远远大于健株。钙依赖蛋白激酶基因（JK616046）在病株中的转录水平与健株相比，从接种后10天到25天表达上调，而在接种30天和40天时表达降低。醌还原酶家族蛋白（JK616070）基因在接种后15天到30天，相对健株，在病株中的表达量均降低，只在接种后40天在病株中的表达量大于健株。热休克转录因子(JK616021)和JK616047（MYB家族转录因子）的转录量在接种后15天以前,在病、健组织中无显著区别，在接种15天以后病株表达量均大于健株。病程相关蛋白基因PR4（JK616077）在病株中的表达量均大于健株，在接种后40天，在病株的表达量显著增高。其中，乙烯反应转录因子、钙依赖蛋白激酶基因、热休克转录因子和病程相关蛋白基因可能与植物的抗病性相关，而脱落酸受体、醌还原酶家族蛋白、MYB家族转录因子可能与根肿病的病程相关。4）茎瘤芥防御应答的激素诱导测定：采用脱落酸、茉莉酸甲酯、乙烯和水杨酸四种不同激素诱导处理茎瘤芥植株，检测处理植株CDPK（钙依赖型蛋白激酶）基因和PR4(病程相关蛋白)基因的表达，结果显示，脱落酸（abscisic acid, ABA）处理能显著诱导CDPK（钙依赖型蛋白激酶）基因的表达，茉莉酸甲酯(methyljasmonate, MeJA)、乙烯（ethylene, ET）和水杨酸（salic acid, SA）均抑制CDPK的表达。水杨酸能显著诱导PR4基因的表达，脱落酸、乙烯、茉莉酸甲酯均抑制PR4基因的表达。5）重要功能基因序列全长克隆与特性鉴定：利用RACE技术扩增了乙烯反应转录因子（ERF）基因和病程相关蛋白PR4基因的全长序列，对2个基因进行了结构和功能的生物学信息分析。所测的乙烯反应转录因子序列（943bp）包括666bp开放阅读框，277bp的3’非翻译区，编码221个氨基酸。所测得的的病程相关蛋白PR4序列（584bp）包括423bp开放阅读框，161bp的3’非翻译区，编码141个氨基酸。对蛋白质基本特性分析表明，乙烯反应转录因子编码的蛋白质的相对分子质量为24413.1Da，理论等电点为6.35；病程相关蛋白编码的蛋白质的相对分子质量为15.5kD，理论等电点为8.13。信号肽和跨膜结构预测表明，乙烯反应转录因子基因编码的蛋白质没有信号肽和跨膜结构；病程相关蛋白基因编码的蛋白存在信号肽，没有跨膜结构。疏水性预测表明乙烯反应转录因子基因编码的蛋白质和病程相关蛋白具有亲水性。功能位点预测表明，乙烯反应转录因子编码的蛋白质具有AP2/ERF功能域；而PR4基因编码的蛋白质具有完整的DPBB-1超家族保守结构域。系统进化树分析表明，茎瘤芥ERF蛋白与甘蓝、油菜等十字花科作物亲缘关系较近，与白菜的PR4蛋白亲缘关系最近。在完成ERF基因的克隆与鉴定基础上，已成功构建ERF超表达载体,通过农杆菌遗传转化，获得2株拟南芥抗性植株。转基因阳性植株的PCR验证、外源基因表达分析，致病性接种功能验证工作正依序进行。结论：基于茎瘤芥SSH差减文库重要EST序列的研究，筛选鉴定茎瘤芥根肿病病程初期关键上调表达基因，这些基因参与植物防御反应。初步证实乙烯反应转录因子、钙依赖蛋白激酶基因、病程相关蛋白基因和热休克转录因子可能与植物的抗病性相关，而脱落酸受体、醌还原酶家族蛋白、MYB家族转录因子很可能与根肿病的病程相关。