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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是一种定植在猪上呼吸道的革兰氏阴性条件致病菌,是导致保育猪死亡的重要病原菌之一。由于研究起步较晚,人们对其毒力因子及致病机理仍不清楚,这在一定程度制约着对该病的防控。细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)是发现的唯一具有DNase活性的AB型细菌毒素,它能引起DSB(DNA double-strand break)反应,导致真核细胞周期的不可逆阻滞和靶细胞凋亡,在一些病原菌致病过程中发挥着重要作用。由于编码该毒素的基因簇具有相当的保守性,cdt基因很可能是H.parasuis重要的毒力因子,很有必要对其致病作用进行深入的研究。本课题以副猪嗜血杆菌中的cdt为研究对象,通过细胞实验和宿主动物实验从体外和体内两方面水平探究CDT的致病作用。取得的主要研究结果如下:1.自然转化获得cdt基因缺失株通过PCR的方法扩增得到cdt上下游同源臂,gm或kan抗性盒;将上游同源臂、抗性盒和下游同源臂用重叠PCR的方法重叠拼接后,连接到自杀性质粒p K18mobsac B上得到重组质粒p K18-cdt1-UGD和p K18-cdt2-UKD;通过两次自然转化获得JS0135?cdt1::gm?cdt2::kan,简称JS0135?cdt1?cdt2。通过PCR、Southern blot、DNA测序等鉴定方法,证明cdt双拷贝的基因缺失株构建成功。2.H.parasuis中的CDT对PK-15细胞具有毒性作用将不同剂量的野生菌株和cdt缺失菌株分泌蛋白与PK-15细胞互作,3h后继续培养24h、48h、72h,发现野生菌株分泌蛋白组可以使PK-15细胞稀疏,细胞膨胀,核浓染增大,出现空泡,甚至崩解,并且这种毒性作用具有时间和剂量的依赖性,定性地说明了CDT对PK-15细胞具有毒性作用。将适当菌量的野生菌株和cdt缺失菌株分别与PK-15细胞互作4h、6h,然后测细胞的LDH活性,发现野生菌株组细胞毒性强于缺失菌株组的细胞毒性,且差异极显著,定量地说明了CDT对PK-15细胞具有毒性作用。3.H.parasuis中的CDT与细菌的抗吞噬能力相关将野生菌株和cdt缺失菌株与猪肺泡巨噬细胞3D4/2互作,发现野生菌株抵抗3D4/2细胞的能力比缺失株强,说明H.parasuis中的CDT在细菌抗吞噬方面具有重要作用。4.H.parasuis中的CDT对仔猪具有一定程度的致病作用采用三个剂量组的野生菌株和cdt缺失菌株对H.parasuis阴性猪进行胸腔感染,通过临床症状、剖检病变、组织分菌、病理切片等指标比较野生株和缺失株的毒力差异及CDT引起仔猪的典型性病理变化。结果发现cdt缺失菌株较野生菌株毒力有所下降,但没有预期明显。