协调运动行为(Coordinated motor behaviors)是指在完成某种活动时,运动器官有组织的和谐动作。在机体衰老过程中,发生与年龄相关的运动行为缺陷,包括:感觉迟钝、运动发起缓慢、肌力减退和协调运动行为缺陷,是行为衰老的标志之一。年龄相关运动行为缺陷与黑质-纹状体多巴胺能体系在正常衰老过程中出现退行性改变密切相关,黑质-纹状体多巴胺能体系退行性改变导致多巴胺(Dopamine,DA)神经递质的储存、释放和代谢紊乱,引起老年大鼠的自发运动行为、肌力和协调运动行为缺陷。很多实验证实雄性甾体激素(Anabolic androgenic steroids,AAS)能够影响机体行为。丙酸睾酮(Testosterone propionate,TP)替代后增强去势大鼠的抗焦虑行为,增加去势大鼠和老年大鼠静止闻嗅、探索行为、运动行为和修饰行为,恢复去势大鼠交配行为,维持老年大鼠的性功能,出生后早期皮下注射TP可改变大鼠青春期的运动行为。中枢神经系统中雄激素有多种生物学效应,TP替代后增加正常雄性大鼠脑部多巴胺能神经元的功能活动,逆转去势导致的中枢多巴胺能系统功能降低,改善老年大鼠黑质-纹状体多巴胺能体系的功能;TP替代后还能够增加正常大鼠和去势大鼠脑内多巴胺神经递质及其代谢产物的含量。黑质-纹状体多巴胺能系统内,囊泡单胺转运体2(Vesicular monoamine transporter type 2,VMAT2)是位于单胺能神经元突触囊泡膜上的一种跨膜糖蛋白,主要介导突触囊泡对DA的储存和释放,减少胞浆内游离的DA氧化代谢对神经元的损伤。脑内VMAT2的含量能够间接反映脑内多巴胺能神经元的功能状态,有研究表明各种原因引起的VMAT2功能异常,都会影响到脑内DA的储存和释放,最终导致多巴胺能神经元退行性变。以往研究显示,衰老时黑质-纹状体多巴胺能体系VMAT2表达降低。另有流行病学研究发现,与衰老相关的多巴胺能系统紊乱疾病(如帕金森病)多发于老年男性,而老年男性血清睾酮水平显著降低。我们推测,衰老过程中VMAT2表达的下降与雄激素水平下降有关。因此,本研究通过网格棒下降实验(Descending a wire mesh pole)、楔形板行走实验(Tapered beam walking test)和粘附物去除实验(Adhesive removal test),检测鼻腔(Intranasal administration)或皮下(Subcutaneous injection)给予TP对大鼠协调运动行为的影响;通过液质联用技术检测鼻腔或皮下给予TP对大鼠尾壳核内DA及其代谢产物含量的影响;通过RT-PCR技术,免疫印迹以及免疫细胞化学检测鼻腔或皮下给予TP对大鼠黑质-纹状体多巴胺能体系中VMAT2表达的影响;通过给予VMAT2阻断剂利血平,探讨TP对上述指标的影响是否与VMAT2相关;在细胞水平探讨TP对多巴胺能神经元保护作用机制是否通过雄激素受体途径实现的。第一部分丙酸睾酮改善老年大鼠的协调运动行为目的:探讨长期鼻腔或皮下TP替代对大鼠协调运动行为的影响。方法:通过网格棒下降、楔形板行走和粘附物去除实验检测大鼠协同运动行为。结果:1通过网格棒下降实验发现,24Mon大鼠网格棒停留时间较6Mon大鼠短(P<0.01);长期TP处理后老年大鼠停留时间较24Mon组延长(鼻腔95.21%、皮下55.02%)(P<0.01)差异显著。2通过楔形板行走实验发现,24Mon大鼠双后肢楔形板评分较6Mon大鼠高(P<0.01);长期TP处理后老年大鼠双后肢评分较24Mon组降低(左后肢,鼻腔22.56%、皮下11.24%;右后肢,鼻腔19.33%、皮下13.32%)(P<0.01)。3通过粘附物去除实验发现,24Mon组大鼠鼻左、右侧粘附物去除时间较6Mon大鼠长(P<0.01);长期TP处理后老年大鼠鼻部双侧粘附物去除时间较24Mon组缩短(左侧:鼻腔39.29%、皮下38.29%;右侧:鼻腔50.11%、皮下40.64%)(P<0.01)。24Mon组大鼠两前肢粘附物去除时间较6Mon大鼠长(P<0.01);长期TP处理后老年大鼠两前肢粘附物去除时间分别较24Mon组缩短(左侧:鼻腔48.31%、皮下57.63%;右侧:鼻腔49.81%、皮下61.34%)(P<0.01)。结论:1老年大鼠表现协调运动行为缺陷。2老年大鼠长期给予TP替代后,协调运动行为缺陷改善。3老年大鼠鼻腔给予TP对协调运动行为缺陷的改善优于皮下给药。第二部分丙酸睾酮增强老年大鼠黑质-纹状体多巴胺能神经元的功能活动目的:探讨长期鼻腔或皮下TP替代对大鼠尾壳核DA及其代谢产物含量的影响。方法:通过液质联用技术检测大鼠尾壳核内DA及其代谢产物的含量。结果:24Mon组大鼠CPu处DA及其代谢产物水平均较6Mon组明显改变,DA、DOPAC和HVA含量(P<0.01)明显降低;DOPAC+HVA/DA、DOPAC/DA和HVA/DA比值(P<0.01)明显升高;给予TP长期处理后,老年大鼠DA及其代谢产物含量均较24Mon组明显改变,其中DA(鼻腔131.46%、皮下53.87%)、DOPAC(鼻腔38.24%、皮下27.82%)和HVA(鼻腔33.25%、皮下15.79%)(P<0.01)明显升高;DOPAC+HVA/DA(鼻腔35.79%、皮下18.61%)、DOPAC/DA(鼻腔35.24%、皮下16.48%)和HVA/DA(鼻腔37.26%、皮下24.07%)(P<0.01)明显降低,鼻腔给药组基本恢复到6Mon组水平(P>0.05)。结论:1老年大鼠尾壳核内多巴胺神经递质及其代谢产物含量减少。2老年大鼠长期TP替代后,尾壳核内多巴胺神经递质及其代谢产物含量增加,暗示黑质-纹状体多巴胺能神经元的活性增强。3老年大鼠鼻腔给予TP对尾壳核内DA及其代谢产物含量的改善优于皮下给药。第三部分丙酸睾酮增加老年大鼠黑质-纹状体多巴胺能神经元VMAT2的目的:探讨长期鼻腔或皮下TP替代对老年大鼠黑质-纹状体多巴胺能神经元VMAT2表达的影响。方法:通过RT-PCR检测大鼠黑质内VMAT2 m RNA的RQ值,Western blot检测大鼠黑质和尾壳核内VMAT2/GAPDH的比值,免疫组化法检测老年大鼠黑质和尾壳核内VMAT2的平均光密度值和神经元数目。结果:1利用实时荧光定量PCR方法对SN处VMAT2 m RNA的RQ值进行检测发现,24Mon组大鼠SN处VMAT2 m RNA的RQ值较6Mon组降低(P<0.01);长期TP处理后老年大鼠SN处VMAT2 m RNA的RQ值较24Mon组增加(鼻腔77.14%、皮下35.69%)(P<0.01),鼻腔给药恢复到6Mon组水平(P>0.05)。2利用Western blot法对SN处VMAT2蛋白表达检测发现,24Mon大鼠SN处的Glyco-VMAT2、Partially glyco-VMAT2和Native-VMAT2的表达较6Mon组大鼠降低(P<0.01)。长期TP处理后老年大鼠SN处的Glyco-VMAT2(鼻腔65.71%、皮下9.31%)、Partially glyco-VMAT2(鼻腔25.84%、皮下20.15%)和Native-VMAT2(鼻腔72.43%、皮下77.57%)的表达较24Mon组大鼠升高。鼻腔给药组Partially glyco-VMAT2的表达恢复到6Mon组大鼠水平(P>0.05)。3利用Western blot法对CPu处VMAT2蛋白表达检测发现,24Mon大鼠CPu处的Glyco-VMAT2、Partially glyco-VMAT2和Native-VMAT2的表达较6Mon组大鼠降低(P<0.01)。长期TP处理后老年大鼠CPu处的Glyco-VMAT2(鼻腔57.29%、皮下49.22%)、Partially glyco-VMAT2(鼻腔34.40%、皮下9.14%)和Native-VMAT2(鼻腔25.24%、皮下19.23%)的表达较24Mon组大鼠升高(P<0.01)。鼻腔给药组恢复到6Mon组大鼠水平(P>0.05)。4利用免疫组织化学方法对SN处VMAT2-ir免疫阳性细胞数目检测发现,24Mon组大鼠SN处VMAT2-ir免疫阳性细胞数目较6Mon组降低(P<0.01);长期TP处理后老年大鼠SN处VMAT2-ir免疫阳性细胞数目较24Mon组增加(鼻腔27.97%、皮下22.88%)(P<0.01)。5利用免疫组织化学方法对SN处VMAT2-ir免疫阳性细胞AOD值检测发现,24Mon组大鼠SN处VMAT2-ir免疫阳性细胞AOD值较6Mon组降低(P<0.01)。长期TP处理后老年大鼠SN处VMAT2-ir免疫阳性细胞AOD值较24Mon组增加(鼻腔6.90%、皮下8.75%)(P<0.01)。6利用免疫组织化学方法对CPu处VMAT2-ir免疫阳性神经末梢AOD值检测发现,24Mon组大鼠CPu处VMAT2-ir免疫阳性神经末梢AOD值较6Mon组降低(P<0.01)。长期TP处理后老年大鼠CPu处VMAT2-ir免疫阳性神经末梢AOD值较24Mon组增加(鼻腔20.18%、皮下6.95%)(P<0.01),鼻腔给药恢复到6Mon组水平(P>0.05)。结论:1老年大鼠黑质内VMAT2-ir免疫阳性细胞数目减少,给予TP后增加。2老年大鼠黑质-纹状体多巴胺能神经元VMAT2 m RNA和VMAT2蛋白表达减少。3老年大鼠长期给予TP替代后,能够在转录和翻译水平提高黑质-纹状体多巴胺能神经元VMAT2表达。4老年大鼠鼻腔给予TP对黑质-纹状体多巴胺能神经元VMAT2的改善优于皮下给药。第四部分VMAT2参与丙酸睾酮对老年大鼠的协调运动行为和黑质-纹状体多巴胺能神经元功能活动的改善目的:探讨老年大鼠TP长期替代后协调运动行为和黑质-纹状体多巴胺能神经元的功能活动明显改善,是否与VMAT2表达增多相关。方法:应用VMAT2长效特异性抑制剂利血平预先处理老年大鼠,然后给予TP皮下替代治疗。通过网格棒下降,楔形板行走和粘附物去除实验检测大鼠协同运动行为,液质联用技术检测大鼠尾壳核内DA及其代谢产物的水平,RT-PCR检测大鼠黑质内VMAT2 m RNA的RQ值,Western blot检测大鼠黑质和尾壳核内VMAT2/GAPDH的比值。结果:1利血平处理(24Mon-R)组和利血平和TP处理(24Mon-R.TP)组大鼠网格棒下滑和楔形板行走无法进行。2通过粘附物去除实验发现,24Mon-R组大鼠鼻两侧和两前肢粘附物去除时间分别较24Mon组大鼠长(P<0.01);24Mon-R.TP组大鼠鼻两侧和两前肢粘附物去除时间均较24Mon-R组长(P<0.01)。3通过液质联用检测技术检测老年大鼠尾壳核内DA及其代谢产物的含量并计算其比率发现,DA及其代谢产物(DOPAC和HVA)24Mon-R组明显低于24Mon组(P<0.01),DA代谢产物与DA的比值明显升高(P<0.01);24Mon-R.TP组尾壳核内DA含量明显低于24Mon-R组(P<0.01),DA代谢产物(DOPAC和HVA)与24Mon-R组无明显差异(P>0.05),DA代谢产物与DA的比值明显升高(P<0.01)。4利用RT-PCR方法对SN核团处VMAT2/GAPDH的RQ值进行检测发现,24Mon-R组与24Mon组无明显变化(P>0.05),24Mon-R.TP组明显增加(P<0.01)。5利用Western blot法对SN和CPu处VMAT2蛋白表达检测发现,Glyco-VMAT2、Partially glyco-VMAT2和Native-VMAT2与GAPDH免疫印迹条带相对吸光度比值,24Mon-R组与24Mon组无明显变化(P>0.05),24Mon-R.TP组分别明显增加(P<0.05)。结论:1利血平抑制VMAT2的功能、减少DA及其代谢产物的含量、提高DA代谢产物与DA的比值和损伤协调运动行为。2 TP对老年大鼠协调运动行为和黑质-纹状体多巴胺能神经元功能的影响可能部分通过VMAT2实现的。第五部分睾酮提高SH-SY5Y细胞VMAT2表达与雄激素受体相关目的:在细胞水平探讨睾酮(Testosterone,T)提高VMAT2表达和神经保护作用是通过雄激素受体(Androgen receptor,AR)实现的方法:RA/TPA分化的SH-SY5Y细胞作为DA神经元体外研究模型;利用H2O2作为ROS激发剂;预先给予T和AR阻断剂氟他胺(Flutamide,Flu)处理,通过MTT和LDH检测SH-SY5Y细胞损伤程度,通过免疫荧光和免疫印记检测VMAT2表达的变化。结果:1 RA/TPA分化SH-SY5Y细胞后,出现胞体变圆变小,突起增长等形态学变化。Neu N检测结果显示RA/TPA分化细胞Neu N的表达明显(P<0.01)高于未分化细胞。2 MTT和LDH检测结果显示,对照(Con)组、睾酮处理(T)组和睾酮和氟他胺处理(T+F)组三组间细胞活性没有明显变化(P>0.05),过氧化氢处理(H)组、睾酮和过氧化氢处理(T+H)组和睾酮、氟他胺和过氧化氢处理(T+F+H)组三组细胞活性均较Con、T和T+F三组降低(P<0.01),H和T+F+H组细胞活性低于T+H组(P<0.01)。3免疫荧光结果显示:Con和T+F组间AOD值没有明显差异(P>0.05),H、T和T+F+H三组间AOD值没有明显差异(P>0.05),H、T和T+F+H三组的AOD值明显高于Con和T+F组(P<0.01),T+H组明显高于其余5组(P<0.01)。4免疫印记结果显示:Glyco-VMAT2与GAPDH免疫印迹条带相对吸光度比值,H、T和T+F+H三组间没有明显差异(P>0.05),H、T和T+F+H三组间明显高于Con和T+F组(P<0.01),T+H组明显高于其余5组(P<0.01)。Partially glyco-VMAT2和Native-VMAT2与GAPDH免疫印迹条带相对吸光度比值,Con、H、T、T+F+H和T+F五组间均无统计学意义(P>0.05),T+H组明显高于其余5组(P<0.01)。结论:1睾酮对H2O2损伤SH-SY5Y细胞的神经保护作用部分通过AR实现的。2睾酮使SH-SY5Y细胞VMAT2表达提高部分通过AR实现的。3氧化应激能够通过非AR途径提高VMAT2表达。