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流感病毒(Ⅳ)是一种重要的呼吸道病原体,可导致季节性和全球性大流行。Ⅳ根据其核蛋白(NP)可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)四种型别,其中A型和B型流感病毒可能会引起季节性的流行;根据血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶(NA)的差异,IAV又可分为多种亚型。20世纪,发生过三次IAV大流行,分别是:A/Spain/1918(H1N1)、A/Asian/1957(H2N2)和A/Hong Kong/1968(H3N2),流感病毒的暴发和传播会对公共卫生安全和全球经济构成严重威胁。现用于治疗流感的药物主要是M2离子通道抑制剂和NA抑制剂,由于抗病毒药物的滥用,可能会导致耐药性毒株的产生。鉴于流感病毒的耐药性和突变性,接种疫苗是预防流感病毒的最有效方法。WHO-GISRS持续监视人类中传播的流感病毒并每年两次更新流感疫苗的成分,现已开始支持四价疫苗的研发,有望为流感病毒感染提供更广泛的保护。但是一旦疫苗抗原错配,则可能导致难以估计的损失,因此亟需研发广谱/通用流感病毒疫苗以防止高度变异性的病毒破坏。HA是流感病毒表面重要的糖蛋白之一,可以诱导广泛的保护性免疫应答,并且HA颈部区的氨基酸序列相对于头部区保守性较高,所以对HA蛋白的广谱流感疫苗的研发极为关注。实验室前期研究筛选出一段针对于H3亚型的简短线性优势基序,即16肽,并将其偶联到MAP4和NoV particle载体上进行原核表达和动物实验,但由于MAP4的免疫原性较弱和诺如病毒有预存免疫的风险,因此为了进一步增强16肽的免疫原性和疫苗载体的安全性,本研究的目的是通过原核表达体系选择一个合适的疫苗载体。DNA疫苗与传统蛋白疫苗相比更稳定、更安全,且与真核蛋白表达相比更经济、更方便,为了进一步测定16肽在真核体系的免疫原性,本研究拟同时进行DNA疫苗的免疫。来源于幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的Ferritin蛋白具有热稳定性和化学稳定性,24个Ferritin亚基可以自组装成12nm的球形空心纳米笼状结构,是一种高效的抗原传递纳米平台。本研究将筛选的16肽与Ferritin的N末端结构域偶联构建重组质粒H16-Ferritin,经原核体系表达、纯化、复性后辅以MF59佐剂按照20μg/200μL/只的剂量进行小鼠皮下免疫,免疫间隔2周,共计免疫4次。实验结果显示第四次免疫后的血清具有一定的结合活性和中和活性,但低于其他疫苗载体,如NoV particle、MAP4;MF59作为流感疫苗佐剂具有很高的效价和应用前景。为了进一步测定16肽在真核体系的免疫原性和Ferritin作为疫苗载体的潜力,本研究将基因优化后的16肽和HA全长分别与Ferritin偶联构建重组质粒H16-Ferritin和HA-Ferritin,将重组质粒按照100μg/只辅以基因导入仪进行小鼠腿部肌肉DNA疫苗免疫,免疫间隔2周,共计免疫3次。结果显示HA-Ferritin组免疫血清对H3N2毒株具有很高的结合活性、中和活性、血凝抑制活性,而16肽组免疫血清均无活性。综上所述,本研究以增强简短表位16肽的免疫原性和疫苗载体的安全性为出发点,重点围绕以Ferritin载体搭载表位16肽和HA全长进行的原核体系重组蛋白疫苗和真核体系DNA疫苗的研究。本研究成功评价了筛选的简短表位16肽对H3亚型流感病毒具有较高的免疫原性和良好的中和活性,但由于表位分子量较小其活性受抗原载体和免疫佐剂影响较大。DNA疫苗免疫结果显示以Ferritin为载体在真核体系内呈递大分子量的免疫原具有很强的载体优势,若以Ferritin作为疫苗载体呈递短肽需要充分考虑短肽的性质和组合方式以期发挥其免疫优势。虽然DNA疫苗的效价相对蛋白疫苗较低,但疫苗序列、载体和佐剂的正确选择凸显了其对未来医疗的重要作用。本课题进一步优化了广谱中和流感疫苗的制备技术及质量评价方法,本研究中此简短HA2颈部表位的设计广谱性较高,生产成本低廉,为广谱流感疫苗的研发奠定理论基础,DNA疫苗的初步探索也为后续新型疫苗的研发提供参考。