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目的:本课题拟采用宫颈癌前病变脱落细胞为生物样本,通过指数富集的的配基系统进化技术（SELEX技术）筛选获得宫颈癌前病变脱落细胞的高特异性核酸适配子,初步实现对宫颈癌前病变分级的目的;利用该适配子分离提取相应的膜靶蛋白,为建立新的、高效的宫颈癌前病变分子诊断方法奠定理论和实验基础。研究方法及结果:1.适配子文库及引物的设计和合成使用Prime Premier 5.0软件设计适配子文库及引物。ssDNA适配子全长90nt,两端为18nt的固定序列,且作为引物结合位点,中间为54nt随机序列,库容量达1016。上游引物P1与适配子5’端固定序列相同,下游引物P2与适配子3’端固定序列互补。2.PCR扩增反应条件优化确定对称PCR扩增反应最佳退火温度为49.5℃,最佳循环数为15个循环,间接不对称PCR扩增反应最佳上下游引物浓度比为80:1,最佳循环数为35个循环,为成功制备次级文库提供保证。3.SELEX筛选特异性适配子库以液基薄层细胞检测（TCT）确定为上皮内低级别病变（CIN1）和高级别病变（CIN2、CIN3）的宫颈脱落细胞为靶细胞,正常细胞、炎性宫颈脱落细胞为反筛细胞,经过12轮筛选,获得靶细胞的特异性适配子库。4.适配子库克隆测序和结构分析将第10轮获得的适配子进行克隆测序,获得9个特异性适配子,分别命名为Cervical Intraepithelial Neoplasia Aptamer 1-9（CIN-Ap1-9）。适配子同源性分析:除CIN-Ap2、CIN-Ap3、CIN-Ap4和CIN-Ap9含有保守序列GGGAT外,其他适配子无共同保守序列。适配子二级结构预测:9个适配子均为不同形式茎环结构,茎环结构可能是适配子与靶标物质特异性结合的结构基础。5.适配子特异性和亲和力分析利用荧光分析法和拟合结合曲线计算Kd值测定分析9个适配子的特异性和亲和力。其中CIN-Ap4与CIN1结合显示出较高特异性,CIN-Ap5与CIN2/CIN3结合显示出较高特异性。据此初步确定,CIN-Ap4、CIN-Ap5可作为宫颈癌前病变高特异性适配子。6.CIN-Ap4高特异性细胞免疫荧光验证采用细胞免疫荧光法进一步验证了适配子CIN-Ap4主要与CIN1脱落细胞呈高特异性结合。7.CIN-Ap4膜靶蛋白的制备及SDS-PAGE鉴定生物素标记CIN-Ap4,利用适配子-生物素-链霉亲和素磁珠方法分离、提取膜靶蛋白;通过SDS-PAGE纯度鉴定,该蛋白分子量大小在20-25KDa,具有作为宫颈癌前病变标志物的潜在可能。结论:1.筛选获得了能与宫颈上皮内低级别病变（CIN1）及高级别病变（CIN2/CIN3）细胞高特异性、高亲和力结合的适配子CIN-Ap4及CIN-Ap5,初步实现对宫颈癌前病变分级的目的。2.获得了能与宫颈癌前病变高特异性适配子CIN-Ap4结合的膜靶蛋白,为后续对该蛋白的深入研究提供材料。