沙穗(Eremostachys moluccelloides Bunge)是唇形科沙穗属的一种植物。其为多年生草本,高大约25-30厘米,根茎处有绵毛状具节白长柔毛,茎粗壮,单一或分枝,基部近圆形,边缘具锐锯齿,上面疏生短而扁平的柔毛,下面密被具节绵状长柔毛,叶为椭圆形,基部近圆形,边缘具锐锯齿,上面疏生短而扁平的柔毛,下面密被具节绵状长柔毛,花无梗,白、黄白至黄色,花萼管状钟形,花期为6-7月,果期为7月。主要分布于西亚及中亚,包括伊朗、阿富汗等国家,我国分布在新疆,生于砾质砂质戈壁干旱地。唇形科植物分布广泛,分布较广的属有黄芩属、夏枯草属、水苏属、鼠尾草属、罗勒属、百里香属、糙苏属等。唇形科植物富含多种挥发油,其中不少挥发油成分已经作为药用成分得到广泛应用。作为芳香油植物得到广泛应用的包括薄荷、迷迭香、薰衣草等,作为药用植物得到广泛应用的有黄芩、丹参、益母草、夏枯草等。研究表明,该科中植物主要含有的化学成分包括挥发油类化合物、三萜类化合物、酚酸类化合物、黄酮类化合物以及环烯醚萜类化合物。该属即沙穗属中,包含约60种植物,主要分布在中亚、西亚,我国有两种,主要分布在新疆省。目前对该属的研究不是很广泛,且大多数研究集中在挥发油成分的鉴定。在对Eremostachys laciniata化学成分的研究中,发现该种植物中富含环烯醚萜苷、苯乙醇苷以及黄酮类化合物,且环烯醚萜苷类化合物具有明显的抗菌活性。在对Eremostachys laevigata Bunge化学成分的研究中,发现该植物中含有的挥发油类化合物具有抗菌和抗氧化的活性。目前为止,对该种植物化学成分的研究较少,其中有三篇报道主要研究挥发油成分,表明主要含β-榄香烯、γ-榄香烯、1,8-桉树脑以及榄香醇等挥发性成分。另外三篇报道主要集中在化学成分和各种活性的研究,研究表明,该种植物中富含环烯醚萜苷类化合物且具有不同程度的抗菌、抗氧化以及抗疟疾等活性。该种植物研究的局限性促使我们探究更多的化学成分以及生物活性。本课题主要研究沙穗属植物沙穗的化学成分、化学分类学的意义以及细胞毒活性。植物全株用甲醇进行提取得到浸膏,再采用硅胶色谱柱、大孔树脂柱、凝胶柱以及分析和制备型高效液相色谱仪等一系列分离方法进行分离和纯化,最终分离得到十八个单体化合物,通过对其紫外光谱、高分辨质谱、一维和二维核磁共振谱的解析以及与已发表文献数据的比对,进行结构鉴定,最终确定一个新化合物和十七个已知化合物,其中包括七个黄酮类化合物、三个酚酸类化合物、三个环烯醚萜苷、二个苯乙醇苷类化合物、一个单萜类化合物以及两个二萜类化合物。化学名称分别为:木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(1),毛蕊花苷(2),绿原酸(3),松果菊苷(4),luteolin 7-O-(6??-O-β-D-apiofuranosyl)-β-D-glucopyranoside(5),芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖苷(6),反式-桂皮酸(7),香草酸(8),apigenin-7-O-(6′′-E-p-coumaroyl)-β-d-glucopyranosidel(9),apigenin7-O-(3",6"-E-p-dicoumaroyl)-β-glucoside(10),lamalbide(11),6β-hydroxy-7-epi-loganin(12),phloyoside II(13),5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavone(14),地芰普内酯(15),5-Hydroxy-7-methoxy-2-(4-methoxyph-enyl)-4H-chromen-4-one(16),14-hydroxyabieta-8,11,13-triene-18-oic-12-carboxy-13-(hydroxymethyl)-lactone(17),2β,14-dihydroxyabieta-8,11,13-triene-11-carbald-ehyde-12-carboxy-13-(hydroxymethyl)-lactone(18)。这些化合物中,化合物1-10,13-18为首次从该种植物中分离得到,化合物3,4,7,8,10,14-18为首次从该属中分离得到,化合物18为新化合物,第一次从该科中分离得到,其余已知化合物均已从该科中报道过。这些化合物的分离以及结构鉴定,丰富了该种植物化学成分的多样性,同时也具有化学分类学意义。这十八个化合物中,化合物1-16均为已知且在各种植物中广泛分布。而两个二萜类化合物17和18具有代表性,因为这是第二篇关于这种四元母核的报道,化合物17仅从块根糙苏中分离得到,而化合物18为首次报道。本课题也研究化合物5、9、10、11、12、13、17、18这八个化合物对人肝癌细胞Hep G2和乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用。将细胞铺于96孔板,将这八个化合物分别以100 um的浓度给药,每个化合物设置3个复孔,不加药物组做空白对照和阴性对照组,阿霉素作为阳性对照,CCK-8法进行测定,分析每种化合物的抑制率。结果显示,仅有化合物12对Hep G2细胞有微弱的抑制作用,化合物18对MCF-7有微弱的抑制作用,其余化合物对这两种癌细胞均没有明显的抑制作用。在本课题研究中,分离方法的选择尤为重要。采用四种不同极性的溶剂对该植物的甲醇提取物进行萃取,这四种溶剂分别为:正己烷、二氯甲烷、正丁醇以及水,萃取后得到极性由小到大的四个组分。由于正己烷相组分的化合物极性小,主要为挥发油类的化合物,且近些年来人们对其挥发油类化合物的研究已经较为广泛,所以本课题不着重对该组分进行研究。对于极性最大的水相组分,由于该组分化合物分子较大,含糖类比较多,本课题对本组分没有进行具体研究。而二氯甲烷相和正丁醇相化合物极性居中,含有大量小分子化合物,且之前人们对其没有太多的研究,因此本课题选择这两相组分进行具体的化学成分的分离纯化及结构鉴定。二氯甲烷相组分的极性相对较小,因此对此相首先采用薄层色谱及硅胶柱色谱法进行分离,薄层色谱法中展开剂的选择主要为正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯,采用合适的展开比例,使其展开斑点的比移值在0.2～0.3,找到合适的展开条件后采用硅胶柱层析进行分离;样品采用干法拌样,使样品与硅胶进行充分且均匀地吸附,选择合适大小的硅胶柱以提高分离效果;洗脱剂的选择与薄层色谱中展开剂的选择基本一致,由于二氯甲烷相组分还比较复杂,所以采用梯度进行洗脱,在等度洗脱一定程度之后慢慢增加洗脱剂的极性,使不同极性的化合物能够得到充分地洗脱;在采用硅胶柱层析进行大致分离后,得到成分较之前单一的不同组分,对于极性小的组分可采用进一步的硅胶柱层析进行纯化,或者根据分子量大小的差异采用凝胶柱色谱进一步分离,对于极性稍大的组分,其在甲醇中的溶解度很好,可以适当采用反相制备型高效液相色谱仪进行分离,从而最终得到单体化合物。而用正丁醇萃取得到的组分极性相比于二氯甲烷相化合物的极性较大,含有的糖类化合物较多,首先采用HP-20大孔树脂柱进行大致分离,洗脱剂按照极性大小分别采用纯水、25%甲醇-水、50%甲醇-水、75%甲醇-水以及100%甲醇,这样能将成分复杂的正丁醇萃取物按照极性大小分成五部分,为了使分离效果更好,每种洗脱剂分别洗脱三次,即最终得到十五个流分,采用反相高效液相色谱仪对其进行分析,将成分相似的流分进行合并;由于各个流分极性相对较大,且在反相洗脱剂中的溶解度较好,所以该组分主要采用制备型反相高效液相色谱仪进行分离纯化,最终得到不同的单体化合物。得到不同的单体化合物后,对其进行结构鉴定。通过紫外光谱仪得到各个化合物的紫外吸收特征,通过高分辨质谱得到化合物的分子量信息,通过一维、二维核磁共振谱得到化合物结构信息,再通过旋光仪测得旋光度与文献进行比对得到化合物的立体结构信息。掌握对核磁共振谱图进行解析尤为重要。选择合适的氘代溶剂将单体化合物进行溶解,使其澄清透明,无不溶颗粒及沉淀,且氘代试剂的溶剂峰不要与化合物的特征峰相重叠;与氮原子、氧原子、硫原子相连的氢为活泼氢,要想看活泼氢则要选择氘代氯仿或氘代二甲基亚砜作为溶剂,在氘代二甲基亚砜中活泼氢的出峰位置要比在氘代氯仿中偏低场些,活泼氢由于受氢键、温度、浓度等因素的影响,化学位移值会在一个范围内变化。首先从氢谱中通过不同氢的化学位移、积分以及峰的裂分和偶合常数的大小可以大致判断化合物的种类,尤其是黄酮类化合物;从碳谱中可以判断出化合物的碳原子数,碳谱大致分为三个区:羰基区,化学位移一般大于160ppm;不饱和碳原子区,化学位移在90-160ppm,烯、芳环以及其他sp~2杂化的碳原子均在此范围内,连氧芳碳化学位移在140-165ppm;脂肪碳原子区,饱和碳原子若不直接连接杂原子,化学位移一般小于55ppm,若连接杂原子,则碳的化学位移大于55ppm小于100ppm;结合DEPT谱可以得到不同碳的种类:伯碳、仲碳、叔碳和季碳;在对化合物的碳原子和氢原子进行解析之后,再根据HSQC谱对氢原子和碳进行相应的归属,得到碳原子和氢原子的关系;氢与氢之间的关系可以通过COSY谱进行分析,得知同碳、邻碳上的氢;在对化合物结构有大致了解之后,再通过HMBC谱得知碳和氢的远程偶合关系,进行充分地验证。通过不同的谱图、方法对化合物的结构进行解析,最终确定了已分离得到的单体化合物的化学结构。本课题通过对沙穗属植物沙穗化学成分的研究,丰富了其多样性,使人们对其认识更加广泛,同时为其生物活性的研究以及应用奠定了基础。