家蚕作为重要的经济昆虫,其价值主要在于蚕丝和蚕蛹。若生产上能够做到专养雄蚕,不仅可以提高蚕丝产量,更能提高蚕蛹品质,但目前家蚕性别决定调控的分子机理还不清楚。课题组在前期研究中发现一个在家蚕卵巢中高表达的核仁小RNA（small nucleolar RNA,snoRNA）Bm-86,并发现其与家蚕性别决定信号通路密切相关。在此基础上本研究首先通过荧光原位杂交法对Bm-86的细胞特性进行了研究,随后在家蚕BmN4细胞系及个体中干涉和过表达snoRNA Bm-86,转录组测序及表型观察研究其对家蚕生殖及性别决定信号通路基因表达的影响,探索其参与家蚕生殖和性别决定的机制,为生产上专养雄蚕提供理论依据。具体研究结果如下:1.snoRNA Bm-86的细胞特性课题组通过荧光原位杂交法,对Bm-86的细胞核质分布情况进行了研究。结果发现snoRNA Bm-86主要在BmN4细胞的细胞核中存在,表明Bm-86主要在细胞核中发挥其生物学作用。2.家蚕BmN4细胞系中干涉与过表达snoRNA Bm-86课题组合成Bm-86的反义寡核苷酸（Antisense Oligo Nucleotide,ASO）探针,干涉Bm-86研究其对家蚕细胞中基因表达的影响。ASO探针转染家蚕BmN4细胞48h后,提取细胞总RNA,Q-PCR检测Bm-86在细胞中的干涉效果。结果显示,与阴性对照相比,Bm-86的表达量下降60.36%,干涉效果显著。随后使用RNA-seq对干涉Bm-86后的BmN4细胞系进行转录组测序,结果发现,松弛素Relaxin信号通路基因出现显著差异表达的基因数量较多。Relaxin信号通路在妊娠、分娩及女性生殖方面起重要作用,干涉Bm-86后该信号通路基因的差异表达变化较大表明Bm-86参与了家蚕的生殖调控。细胞中干涉Bm-86后,转录组数据显示出现外显子跳跃的基因比例上升,内含子滞留基因比例下降,表明Bm-86参与了基因组水平的基因可变剪接。课题组成功构建了Bm-86的过表达载体pIEx-4[Bm-86],研究Bm-86对家蚕细胞系中基因表达调控的影响。过表达载体转染BmN4细胞48h后,抽提细胞总RNA,Q-PCR检测Bm-86在细胞中过表达效果。结果表明,与转染空载体的对照相比,Bm-86表达量上调15.50倍,过表达效果显著。转录测序结果显示,过表达snoRNA Bm-86后,Rap1信号通路出现差异表达的基因数较多。Rap1信号通路与雄性生殖密切相关,过表达Bm-86后该信号通路基因的差异表达基因数量增多也表明Bm-86参与了生殖相关信号通路基因的表达调控。3.家蚕个体中干涉snoRNA Bm-86表达课题组在5龄3天家蚕血淋巴中注射Bm-86反义寡核苷酸探针干涉Bm-86表达,Q-PCR检测Bm-86表达量的变化。结果表明,卵巢和非卵巢的Bm-86的表达量与阴性对照相比分别下调43.57%和33.17%,均显著降低（卵巢:P=0.0199非卵巢:P=0.0400）。性别决定信号通路关键基因fem表达量显著下降。4.家蚕个体中过表达snoRNA Bm-86课题组构建Bm-86的过表达载体pIEx-4[Bm-86],探究Bm-86在家蚕性别分化中的调控机。对5龄3天的雄蚕过表达Bm-86时发现,在精巢组织和非精巢组织中snoRNA Bm-86的表达量未出现上调。在对5龄9天雄蛹的过表达中显示,与对照相比,精巢组织中Bm-86的表达量上升2.15倍,非精巢组织中上升20.17倍,均实现显著过表达。性别决定信号通路关键基因fem上调表达显著,表明Bm-86在家蚕性别决定信号通路的上游基因表达调控中发挥关键作用。本论文通过定位核仁小RNA Bm-86在细胞中的位置,在家蚕细胞系及个体中干涉和过表达Bm-86,转录组测序系统研究了核仁小RNA Bm-86参与家蚕性别决定及生殖调控的分子机制,发现Bm-86可能通过调控全基因组水平基因的可变剪接影响了家蚕性别决定上游基因fem及生殖发育关键信号通路Relaxin和Rap1基因的表达,从而参与家蚕生殖调控。该研究为进一步探索家蚕性别决定和生殖发育的分子机制提供了理论依据,为从小RNA角度开展家蚕雄性不育和转基因改良奠定了基础。