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本研究从构建禾本科植物高效表达载体入手,采用农杆菌介导法将cry8Eal,cry8Gal基因分别导入草坪草匍匐剪股颖中,成功获得了转基因抗虫匍匐剪股颖植株。
本研究首先利用PCR方法从水稻中克隆了单子叶植物过氧化氢酶CatB基因的启动子(-329到+298),与GenBank中公布的序列完全一致。然后构建了四个植物表达载体p3300-Ubi-8G(组成型表达启动子Ubiquitin:cry8Gal基因)、p3300-CatB-8G-(根部强表达启动子CatB:cry8Gal基因)、p3300-Ubi-8E(组成型表达启动子Ubiquitin:cry8Eal基因)和p3300-CatB-8E(根部强表达启动子CatB:cry8Eal基因),通过农杆菌介导法导入到匍匐剪股颖中,经草丁膦筛选得到抗性植株。
在得到抗性植株的基础上,进行了分子检测。利用cry8Eal、cry8Gal基因检测引物分别进行PCR检测,共得到转p3300-Ubi-8G质粒阳性植株19株,转p3300-CatB-8G质粒阳性植株22株,转p3300-Ubi-8E质粒阳性植株22株,转p3300-CatB-8E质粒阳性植株28株。PCR产物测序结果与cry8类基因吻合,初步证明cry8Eal、cry8Gal基因己整合到匍匐剪股颖基冈组中,Southern杂交正在进行。对于PCR阳性植株转录水平的分析表明,cry8Eal、cry8Gal基因在部分转基因株系中可以正常转录。半定量RT-PCR结果显示,不同株系间的表达量有明显差异,而且由水稻CatB启动子驱动的外源基因在根中的表达量远远大于在叶子中的表达量,后者只有微弱的表达。通过ELISA的检测,确定转基因植株能表达蛋白Cry8Eal,由CatB启动子驱动的Cry8Eal蛋白占根中可溶性蛋白的百分比最高可达5.37%。在初步的生物活性测定中,转cry8Eal基因植株与未转化植株相比接种暗黑鳃金龟幼虫30天后,大部分植株都可以正常生长发育,表现出良好的抗蛴螬的效果。
本项研究为抗虫草坪草新品种的大规模选育奠定了坚实的基础,对防治草坪草金龟子虫害和草坪草抗虫新品种培育具有重要的意义。