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肿瘤的发生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活和凋亡相关基因的改变导致细胞增殖分化和死亡失调的结果。针对恶性肿瘤发生的遗传学背景，引入外源性目的基因到肿瘤细胞或其它体细胞内以纠正或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的，即为肿瘤的基因治疗。将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因转导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生某些酶类，将原来无毒的抗病毒药物或化疗前体药物代谢转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞，这种使肿瘤细胞自杀的基因称为“自杀基因”（suicide gene）。自杀基因治疗因独有的旁观者效应（bystander effects）,不需要所有的肿瘤细胞均被转导即可取得显著疗效，可克服基因转导效率低的缺陷，又可与放射治疗、免疫基因治疗联合应用，是目前较为有效并具有临床应用前景的基因疗法。目前肿瘤基因治疗研究中广泛应用的自杀基因主要有：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）和细菌胞嘧啶脱氨酶基因（CD）。胰腺癌目前发病率呈上升趋势，70%-90%的病人确诊时已丧失手术时机，5-氟尿嘧啶（5-FU）常应用于胰腺癌的治疗，但由于其全身的不良反应较大而限制了其疗效。胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD）基因是来源于真菌及大肠杆菌的一种自杀基因，它表达的CD酶可以使抗真菌药5-氟胞嘧啶（5-FC）脱氨基转化成具有细胞毒的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）。将外源性CD基因转移到肿瘤细胞，给予前药5-FC，CD基因可将对真核细胞相对无毒的5-氟胞嘧啶（5-FC）脱氨基转化成肿瘤化疗药5-FU，从而在肿瘤局部产生高浓度毒性作用以杀伤肿瘤细胞而全身反应较轻。目前转基因方法有病毒和非病毒两类，非病毒载体包括裸DNA直接注射、脂质体法、基因枪等，但因其转导效率低、价格昂贵而受到限制。腺病毒由于其感染宿主范围广，对分裂期和非分裂期细胞均可感染而被广泛应用，这对治疗肿瘤是非常重要的，因为大多数肿瘤处于非分裂状态。所以，我们拟将CD基因以腺病毒为载体转导入胰腺癌细胞，并予前药5-FC，探讨CD/5-FC自杀基因系统对人胰腺癌的杀伤作用及其机理。1． 重组CD基因腺病毒载体的构建及制备目的：构建含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的重组腺病毒载体。方法：用 BamH I 酶切pG1NaCEA-CD，凝胶回收1.5kb的CD基因， 穿梭载<WP=7>体pTrack-CMV经Bgl II酶切线性化与1.5kb的CD基因连接，转化，克隆鉴定，命名为pAdTrack-CMV-CD。pAdTrack-CMV-CD经Pme I酶切线性化，与骨架载体pAdEasy-1混合，在电穿孔仪上转化制备的感受态细菌BJ5183，挑选阳性克隆，酶切鉴定，获重组腺病毒载体，命名为pAd-CD。于转染前将pAd-CD经PacI酶切线形化，按Superfectin转染方法转染人胚肾293细胞。通过荧光显微镜直接观察转基因细胞GFP表达，待贴壁细胞变圆、脱落后，收集培养上清及细胞，反复冻融，收集病毒粗提液。以适当稀释的病毒粗提液，在293细胞中反复扩增至需要量，之后以氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒Ad-CD。结果：pAd-CD酶切鉴定均与预期结果相符。病毒纯化后应用TCID50法测定病毒滴度为2×1011pfu/ml。结论：我们采用的AdEasy TM系统，是一种方便简单的重组腺病毒制备方法，先构建含CD基因的穿梭载体，再与骨架载体一起细菌内同源重组，重组腺病毒载体转染293细胞，由于带有GFP，通过荧光显微镜直接观察荧光，便于噬斑筛选，包装制备较纯含CD的腺病毒。重组CD腺病毒载体的构建成功，为下一步转染胰腺癌细胞并进行体外、体内胰腺癌细胞杀伤作用研究打下了基础。2．CD/5-FC自杀基因系统对胰腺癌体外杀伤作用的实验研究目的：探讨CD/5-FC自杀基因系统对两株胰腺癌细胞株PaTu8988、SW1990的体外杀伤作用及机制。方法：（1）基因转染与细胞体外生长试验：用CD腺病毒以不同MOI（0、0.1、1、10、100、1000）感染体外培养的PaTu8988、SW1990细胞，应用荧光显微镜及流式细胞仪确定转染效率。以MOI为100的感染强度分别将CD腺病毒感染胰腺癌细胞，24小时后加入含各种梯度的前药5-FC，5天后以XTT法检测活细胞比率并计算杀伤率。（2）逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析：抽提转CD基因及亲本PaTu8988、SW1990胰腺癌细胞基因组总mRNA。以下游引物合成cDNA，再以其为摸板，加入10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 1μl，上、下游引物各2ul，Taq酶1μl，进行PCR反应。（3）蛋白质印迹（Western-Blot）分析：抽提转CD基因及亲本PaTu8988、SW1990胰腺癌细胞基因组总蛋白。行SDS-PAGE电泳，将凝胶取出后电转移到硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭后加入抗CD的多克隆抗体及二抗，再经ECL显色，阳性表达可显示出52KD的CD蛋白条带。（4）旁观者效应：将转CD基因的PaTu8988、SW1990细胞与未转基因之胰腺癌细胞分别以100，80，60，20，10，0之比率（%）混合接种至24孔板中，混育24小时后，加入5-FC（终浓度为1.5mmol/L）培养6天后，以XTT法检测活细胞比率并计算杀伤率。<WP=8>结果：应用流式细胞仪分别检测胰腺癌细胞株PaTu8988、SW1990的感染情况，转染率均超过90%。应用RT-PCR技术，成功地从转导CD基因的两株胰腺癌细胞株中扩增出了239bp的片段。应用Western-blot技术，也从CD基因转导的两株胰腺癌?