论文部分内容阅读
大豆蚜(Aphis glycines Matsumura)是近年来发生较为严重的大豆苗期害虫之一,由于化学防治造成的害虫抗药性、农药残留等问题,加速了生物防治被推广和应用的进程。在大豆蚜生物防治措施中,发挥天敌的控害作用是近几年来最受关注的防治策略。利用大豆蚜捕食性天敌进行生物防治首先要明确大豆蚜天敌的优势种群,在此基础上量化评估天敌对大豆蚜有多大的捕食和控制能力,进而制定出切实可行的防治措施。本研究在分析大豆蚜细胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)基因序列基础上,设计特异性引物,以大豆蚜成虫及取食过大豆蚜的捕食性天敌总RNA为模板,通过RT-PCR获得COⅡ基因的DNA片段,用T-A克隆方法将其装载到质粒pMD18-T载体上,经过转化、质粒提取获得标准品,并以此为模板梯度稀释进行Real-time PCR反应,建立检测大豆蚜COⅡ基因拷贝数的标准曲线,并对田间捕食性天敌腹内目标害虫成分进行检测分析,最后拟合天敌发生数量、阳性天敌比率、天敌体内目标害虫成分含量及目标害虫在天敌体内衰变速率,综合评价异色瓢虫幼虫、龟纹瓢虫幼虫、大草蛉幼虫和小花蝽幼虫对大豆蚜的控制能力,为大豆蚜的生物防治提供理论依据。本试验主要研究结果如下:1)设计合成大豆蚜特异性引物,验证该引物对大豆蚜及其同时期发生的其他蚜虫种类包括茄无网长管蚜、桃蚜、玉米蚜、禾谷缢管蚜、麦长管蚜没有扩增效果,且电泳检测结果显示引物特异性良好,可用于荧光定量PCR反应。2)利用PCR技术初步检测捕食性天敌对大豆蚜的捕食作用,在田间随机采集的不同种类天敌,包括异色瓢虫成虫及幼虫、龟纹瓢虫成虫及幼虫、大草蛉成虫及幼虫、小花蝽成虫及幼虫,结果表明,在不同虫态上并不能完全检测到大豆蚜COⅡ基因片段,以检出率做为标准,同种天敌幼虫期对大豆蚜捕食作用检出率较成虫期高,在所检测的4种捕食性天敌类群及其不同虫态中,异色瓢虫幼虫、龟纹瓢虫幼虫、大草蛉幼虫及小花蝽成虫和幼虫对大豆蚜的捕食作用检出率分别为:80%、66.7%、73.3%、56%、60%。3)成功构建利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术检测大豆蚜COⅡ基因表达的标准曲线,通过对标准曲线、扩增曲线及熔解曲线分析,结果表明目的基因拷贝数与Ct值之间呈良好的线性关系,反应特异性较强,无引物二聚体出现,可用于其他样品的检测。4)利用荧光定量PCR反应体系和程序对捕食性天敌阳性反应个体体内大豆蚜COⅡ基因拷贝数进行检测。结果表明,异色瓢虫幼虫体内含有的大豆蚜COⅡ基因拷贝数最大;其次为大草蛉幼虫;再次为龟纹瓢虫幼虫;小花蝽幼虫体内含有的大豆蚜COⅡ基因拷贝数最少。5)检测取食过大豆蚜自然消化不同时间的天敌体内COⅡ基因衰变规律表明,随着消化时间的延长,可检测到大豆蚜目的片段的阳性个体数逐渐减少,并且捕食者体内目的基因片段的拷贝数也随消化时间的延长而减少。并计算出各天敌取食大豆蚜后消化时间对拷贝数对数的相关关系式,异色瓢虫幼虫取食大豆蚜,自然消化0、2、4、6h后时间对拷贝数对数的相关关系式为:A=-0.6517B+3.3024(R~2=0.983);龟纹瓢虫幼虫取食大豆蚜自然消化时间对拷贝数对数的相关关系式为:C=-0.4824D+3.2952(R~2=0.965);大草蛉幼虫取食大豆蚜自然消化时间对拷贝数对数的相关关系式为:E=-0.4715F+3.4319(R~2=0.975);小花蝽幼虫取食大豆蚜自然消化时间对拷贝数对数的相关关系式为:G=-0.4464H+3.2439(R~2=0.939)。6)综合考虑采集天敌数量、天敌阳性比率、天敌腹内食物中目标害虫的含量及目标害虫在天敌腹内的衰变速率等四个因素,评价异色瓢虫幼虫、龟纹瓢虫幼虫、大草蛉幼虫和小花蝽幼虫对大豆蚜的控害能力,上述4种天敌对大豆蚜控制作用从强到弱依次为:异色瓢虫幼虫(R=5.2290×10~6)、大草蛉幼虫(R=1.9628×10~6)、龟纹瓢虫幼虫(R=5.7623×10~5)、小花蝽幼虫(R=5.4086×10~5)。