背景与目的:我国是胃癌高发国及幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）的高感染地区,全球每年胃癌的新发和死亡病例40%以上发生在中国,胃癌的高发与Hp感染密切相关（我国Hp感染率高达55.8%）。早在1994年,Hp已被WHO列为I类致癌因子,且是预防胃癌发生的最重要的可控因素。Hp感染可通过诱导胃黏膜炎症反应、促进DNA损伤、修复失衡及改变胃内微生态结构等过程促进胃黏膜癌变。但确切致病机制仍不明确,值得进一步研究。激活素A受体I型（Activin A receptor type I,ACVR1）蛋白为TGF-β超家族中的骨形态发生蛋白I型受体,含有多个结构域或特异氨基酸序列,参与多种生物学过程。已有研究报道ACVR1的突变可导致进化性肌肉骨化症的发生,且在乳腺癌和肝癌的发生过程中扮演着“促癌因子”的角色。此外,我们前期通过TCGA数据库及体外的Hp感染的转录组测序结果筛选发现ACVR1的表达在Hp感染组明显升高,且胃癌明显高于癌旁,ACVR1的高表达与不良预后显著相关。因此,我们推测ACVR1在Hp感染致胃黏膜癌变中可能发挥重要作用,但具体机制尚不明确。Hp感染致癌的经典病理演变模型为浅表性胃炎-萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-胃癌。肠上皮化生被认为是此过程中的“不可逆点”。尾型同源盒基因2（Caudal Type Homeobox 2,CDX2）作为肠道特异性转录因子在胃黏膜发生肠上皮化生过程中起着关键性的作用。我们构建的ACVR1敲除胃癌细胞与野生型细胞的转录组测序结果提示敲除ACVR1可显著降低CDX2的表达,表明CDX2可能作为ACVR1的下游效应分子发挥促癌作用。基于以上研究背景和我们的前期研究,本课题拟通过人体胃组织标本和细胞层面阐明ACVR1及CDX2在Hp感染致病中的作用及机制,为Hp感染相关胃黏膜病变的防治提供新的理论依据及治疗靶点。材料与方法:（一）ACVR1在胃癌组织中的表达及对胃黏膜细胞生物学行为的影响1.提取TCGA数据库中的胃癌数据并分为Hp阳性和阴性胃癌组,同时联合体外的Hp感染组及对照组的转录组数据筛选Hp致病相关基因,进一步利用GEPIA数据库检测ACVR1在胃癌标本及正常组织中的表达以明确其促癌或者抑癌作用;2.收集胃癌及癌旁组织手术标本,Western blot方法检测ACVR1在胃癌及癌旁的表达;3.进一步通过GEPIA数据库分析ACVR1与胃癌预后的关系;4.Western blot方法检测胃黏膜正常上皮细胞及胃癌细胞中ACVR1的表达。5.构建AGS细胞ACVR1基因敲除细胞（ACVR1-AGS）及鉴定;6.采用CCK-8法、平板克隆形成实验及Transwell实验检测野生型AGS细胞（WT AGS）及ACVR1-AGS细胞生物学行为。（二）Hp感染对胃癌细胞中ACVR1表达的影响1.构建Hp 7.13及Hp PMSS1与AGS细胞共培养模型,通过Western blot检测菌株在不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）的条件下感染细胞后ACVR1的表达;2.构建Hp PMSS1及对应的Cag A敲除菌株（Hp PMSS1 CagA-）与AGS细胞共培养模型,通过Western blot检测毒力因子Cag A对ACVR1的影响。（三）ACVR1在Hp感染致病中的作用及初步机制探讨1.构建Hp 7.13及Hp PMSS1与WT AGS和ACVR1-AGS细胞共培养模型;2.采用CCK-8法及Transwell实验检测Hp菌株与WT AGS和ACVR1-AGS细胞共培养后生物学行为的变化;3.生物信息学分析方法筛选在胃癌细胞中与ACVR1密切相关的信号通路;4.提取WT AGS与ACVR1-AGS转录组测序结果中肠特异性转录因子CDX2的表达量;5.Western blot检测WT及ACVR1-AGS细胞中CDX2的表达;6.Hp 7.13菌株以不同感染复数及感染时间与WT AGS细胞共培养,Western blot检测CDX2的表达;7.Hp 7.13菌株感染WT及ACVR1-AGS细胞后Western blot检测CDX2的表达。（四）胃黏膜不同病理阶段中ACVR1及CDX2的表达及与Hp感染的关系1.免疫组化检测人体胃黏膜肠上皮化生阶段Hp阳性组与阴性组CDX2的表达2.收集内镜下胃黏膜不同病变阶段（胃炎,轻、中、重度肠上皮化生,异型增生,胃癌）标本,通过免疫组化的方法检测各个阶段Hp阳性组与阴性组ACVR1的表达。结果:（一）ACVR1在胃癌组织中的表达及对胃黏膜细胞生物学行为的影响TCGA数据库及体外的Hp感染组及对照组的测序结果发现Hp感染可上调ACVR1的表达且ACVR1在胃癌中的表达明显高于癌旁。我们通过Western blot检测胃癌患者的手术标本中ACVR1的表达,结果与数据库挖掘及体外细胞测序结果一致,且我们发现ACVR1的高表达与胃癌患者的预后差显著相关。我们还检测了胃上皮细胞中ACVR1表达量的差异,结果显示ACVR1在胃黏膜正常上皮细胞中几乎没有表达,在分化程度差的胃癌细胞中的表达明显增高。我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了ACVR1基因敲除的胃癌细胞,通过CCK-8、平板克隆形成实验及Transwell实验探讨ACVR1基因对胃癌细胞生物学行为的影响,结果显示与野生型细胞相比,ACVR1敲除细胞的增殖、克隆形成能力降低,侵袭迁移能力减弱,提示ACVR1基因可影响胃癌细胞增殖和侵袭。（二）Hp感染对胃癌细胞中ACVR1表达的影响我们构建Hp与胃黏膜上皮细胞共培养模型模拟体内Hp感染胃黏膜,通过Western blot检测后发现ACVR1的表达随MOI增加而逐渐地升高,MOI=100或200时ACVR1的表达增加最明显（MOI=100与200时ACVR1的表达无显著差异）,证实Hp体外感染可以上调细胞内ACVR1的表达。我们将Hp PMSS1和Hp PMSS1 Cag A-菌株,分别以MOI=100与AGS细胞共培养,结果显示Hp PMSS1和Hp PMSS1 Cag A-两组间ACVR1的表达没有明显差异。（三）ACVR1在Hp感染致病中的作用及初步机制探讨我们通过CCK-8及Transwell实验检测了Hp感染WT AGS及ACVR1-AGS细胞后细胞生物学行为的改变,发现Hp感染可以促进细胞的增殖和侵袭,但与WT AGS相比,ACVR1-AGS细胞中Hp感染促增殖和侵袭的能力较弱。我们提取WT AGS及ACVR1-AGS细胞的总RNA,采用转录组测序技术进行测序,筛选ACVR1敲除组和野生组细胞间的差异表达基因,利用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行生物功能富集分析。从转录组测序结果基于KEGG数据库注释到的前20条下调的信号通路中,我们筛选到TGF-β/BMP信号通路,其中有27个下调差异基因富集于TGF-β/BMP信号通路,进一步分析发现其关键基因SMAD1、2、4、5在ACVR1敲除组的表达显著低于野生组,Western blot结果显示ACVR1-AGS细胞中通路关键蛋白p-SMAD1/5/8的表达显著降低。肠型上皮的关键转录因子CDX2的表达在ACVR1敲除组中显著降低,采用Western blot方法检测WT AGS及ACVR1-AGS细胞中CDX2的表达,我们发现ACVR1敲除组中CDX2表达水平显著降低。我们以不同MOI将Hp 7.13与AGS细胞共培养12h,通过Western blot检测后发现CDX2的表达随MOI增加而逐渐地升高,MOI=200时CDX2的表达增加最明显,证实Hp体外感染以浓度依赖的方式上调细胞内CDX2的表达,并且我们将Hp 7.13以MOI=200与AGS细胞共培养,通过Western blot检测3,6,9,12及24h时间点CDX2的表达,结果显示共培养12h CDX2的表达达到高峰,24h时CDX2下降。我们将Hp 7.13以MOI=200与WT及ACVR1-AGS细胞共培养12h,Western blot结果发现下调ACVR1可抑制Hp感染后CDX2表达的增加。（四）胃黏膜不同病理阶段中ACVR1及CDX2的表达及与Hp感染的关系我们收集内镜下胃黏膜不同病变阶段的组织标本,通过免疫组化的方法检测ACVR1在各病变阶段中Hp阳性组及Hp阴性组的表达,我们发现Hp可在轻、中度肠上皮化生阶段上调ACVR1的表达。我们检测了内镜下胃黏膜轻、中、重度肠上皮化生组织中CDX2的表达,结果显示Hp阳性组CDX2的表达水平显著高于Hp阴性组,且在Hp阳性组中CDX2的表达与肠化严重程度成正相关。结论:1.Hp感染可上调胃癌促癌基因ACVR1的表达,此过程不依赖于毒力因子CagA;2.ACVR1基因通过调控CDX2的表达在Hp感染致胃黏膜肠上皮化生中发挥重要作用。