MHCI类/肽四聚体技术的报道开创了抗原特异性 T 细胞检测和分析的新纪元。十年来其应用范围已扩展至几乎所有涉及细胞免疫的基础和临床性研究领域。但制作程序繁杂、成本昂贵、生产得率很低的问题也一直阻碍着它的应用。在诸多的技术改进中，将抗原肽与β2m融合而制作由两个亚单位(2C)组成的HLAI类/肽复合体及其荧光四聚体的策略被报道。尽管其制作成本明显下降，但多年来应用很少。原因之一是缺乏系统比较2C型和传统3C型HLAI类/肽复合体的结构和功能性特征的信息。在诸多的应用性研究中，可溶性MHCl类/肽复合体及其多聚体被用来制作磁珠式和胶乳微球式人工抗原提呈细胞(aAPCs)。尽管这两种aAPCs在体外扩增抗原特异性T细胞的能力已被充分证实，但是其在体内诱导抗原特异性T细胞反应的潜能却少有报道。鉴于在体外扩增的特异性CTLs进入体内后经常达不到预期的过继治疗效果，因此进一步研究aAPCs在体内主动免疫治疗中的潜力很有必要。 本研究在三方面开展了工作：建立了可溶性HLAI类/肽复合体及其荧光四聚体的制作技术：利用抗原肽-β2m融合策略制备了2C型HLA-A2/MARTl<,27-35>复合体及其四聚体，系统地比较了其与传统3C复合体的结构和功能性特征：利用2C和3C型HLA-A2/肽四聚体制作了胶乳微球式aAPCs，在naive小鼠体内有效诱导了肿瘤抗原特异性的CTL反应。结果如下： (1)2C、3C型HLA-A2/MARTl<,27-35>复合体和3C型HLA-A2/HER2/neu<,369-377>复合体制备：三种重组质粒pET28a-HLA-A<*>0201(α1-α3)．BSP、pET28a-MARTl<,27-35>-Linker-hβ2m和pET28a-hβ2m被成功构建、表达、纯化和鉴定。HLA-A2重链和轻链融合蛋白以及人工合成的．MARTl<,27-35>和HER2/neu<,369-377>抗原肽在体外被组装折叠、生物素化，然后在FPLC系统中经Superdex 75凝胶层析柱过滤纯化。FPLC洗脱图显示有四个洗脱峰。SDS-PAGE和Western blot分析证实第一洗脱峰是HLA-A2/肽单体复合物的蛋白峰；HLA-A2重链羧基端的His6生物标签未明显影响前者的生物素化效率和四聚体的制备；另外，质谱分析显示起始密码子编码在MARTl<,27-35>肽N端的甲硫氨酸可能在原核表达中已被切除。 (2)2C和3C型HLA-A2/MARTl<,27-35>复合体的生化及结构性特征比较：FPLC洗脱图及其SDS-PAGE和Western blot分析证实：2C型HLA-A2/MARTl<,27-35>单体的分子大小、层析规律等与3C型单体基本一致。但相同条件下前者的折叠效率是后者的2.5倍；ELISA和DDIA实验显示，尽管2C和3C型HLA-A2/MARTl <,27-35>单体均能与单抗W6/32(HLA I类分子构象特异性)和CRll-351(HLA．A2分子构象特异性)以及可溶性受体scFv8.3(HLA.A2/MARTl<,27-35>复合体构象特异性) 呈强烈的特异性的结合反应，但是前者与W6/32和CR11-351的结合力显著低于其3C型复合体(p<0.05，p<0.01)，而与scFv8.3的反应性却显著高于其3C型复合体(p<0.05)；四聚体染色分析黑色素瘤浸润淋巴细胞群TILl和TlL2显示，2C和3C型JLA-A2/MARTl<,27-35>四聚体均能特异性地与膜受体TCR结合，但2C型四聚体在各个剂量组所检测到的tetramer<+>/CD8<+>细胞频率总是比3C型四聚体所测的频率稍高。这种差别在MARTl特异性T细胞较多的TIL2细胞群的染色中尤其明显；稳定性分析提示，2C和3C HLA-A2/MARTl<,27-35>四聚体至少在25C高温条件下的解离速度是相当的。 (3)2C和3C型HLA-A2/MARTl<27-35>复合体激发抗原特异性CTL增殖和杀伤的功能比较：2C和3C HLA-A2/MARTl<27-35>单体复合物分别与TILl细胞群共孵育 3 周后，荧光四聚体染色分析显示，2C与3C单体均能特异性地、有效地刺激MARTl<,27-35>表位特异性CTL增殖，且增殖频率相当：未刺激组的tetramer<+>/CD8<+>细胞频率为0.89﹪，2C和3C单体刺激组则分别升高至3.60﹪和3.02﹪；<51>Cr释放实验显示，2C或3C单体刺激的TILl细胞群均能对黑色素瘤细胞株501和MARTl<,27-35>多肽脉冲的T2靶细胞发挥强烈的特异性杀伤作用，即使在低剂量刺激组，杀伤比率也明显高于未刺激组(p<0.001)。但是，2C单体刺激的TILl细胞群在各个效/靶比例组中溶解靶细胞的能力均明显高于被3C型单体刺激的TILl细胞群(p<0.01)。 (4)胶乳微球式aAPCs在鼠体内诱导肿瘤抗原特异性CTL活化、增殖和杀细胞反应：HLA-A2/K转基因小鼠被胶乳微球式aAPCs免疫接种三次后，其脾细胞在体外被相应的抗原肽刺激1-3天，而后进行细胞内IFN-γ染色、HLA-A2/肽四聚体染色和细胞膜CD69分子的流式分析以及细胞毒杀伤实验等。结果显示：两种由HLA-A2/肽四聚体和抗鼠CD28单抗共同包被的胶乳微球式aAPCs即使在naive小鼠体内，仍然能够有效地诱导肿瘤抗原特异性cTL活化和增殖至对照组小鼠的5-6倍；而且能够有效激发鼠CTL对人肿瘤靶细胞的特异性识别和杀伤，杀伤率在不同效：靶比例处均明显高于未接种组的鼠脾细胞。 这些结果提示：抗原肽-β2m融合的2C型HLA I类/肽复合体是传统3C型复合体的可信替代物，不但生产得率明显提高、制作成本大幅下降，而且更具功能性；利用HLAI类/肽四聚体制作的胶乳微球式aAPCs在naive小鼠体内也能有效地诱导肿瘤抗原特异性的CTL反应，显示了其在主动免疫治疗中的潜在价值。