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植物在整个生命过程中,往往遭受干旱等多种非生物胁迫,从而严重影响植物生长发育。其中部分转录因子,通过结合靶基因启动子上的顺式作用元件调控下游功能基因在抵御逆境胁迫方面起重要作用。NF-Y(Nuclear Factor Y)核因子Y,包含NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基,在植物逆境中起重要调控作用,其中NF-YA亚基受miR169调控。杨树(Populus)是我国人工造林中极为重要的树种,对于经济发展和生态环境建设都有着重要作用。因此,筛选并鉴定杨树抗逆性基因,为进一步通过基因工程手段获得杨树高抗性品种具有重要意义。本论文在实验室前期研究基础上,以木本模式植物毛果杨(P.trichocarpa)为材料,对miR169及其靶基因NF-YA通过转化拟南芥(Col-0)和84K杨(P.alba×P.glandulosa)进行功能分析。主要结果如下:(1)在杨树基因组中共鉴定出13个NF-YA转录因子家族成员,其中PtAF-YA 12和PtNF-YA 13为新发现的两个成员。PtNF-YAl和PtNF-YA3、PtNF-YA5和PtNF-YAl l、PtNF-YA 10和PtNF-YA 13的3对成员分别位于基因组复制区域。结合启动子元件及定量表达分析,NF-YA家族参与植物干旱、ABA和盐胁迫响应,表达模式多样化。此外,杨树PtNF-YA1、2、3、5、6、7、8、10和11共9个成员均存在miR169靶位点,是miR169潜在的靶基因,表明杨树NF-YA可在miR169作用下,多样化的参与植物逆境胁迫响应的调控。(2)获得杨树miR169家族中响应干旱胁迫的PtmiR169o成员,荧光定量分析和PtmiR169o启动子驱动的GUS转基因拟南芥研究结果表明PtmiR169o的表达在干旱、盐和ABA胁迫下诱导上调。超表达PtmiR169o拟南芥在甘露醇渗透胁迫下提高了种子萌发和幼苗根系的生长以及超表达PtmiR169o转基因杨树幼苗阶段均表现出明显的抗甘露醇渗透胁迫能力增强;超表达PtmiR169o拟南芥和杨树在成苗阶段的干旱胁迫下也表现出明显的抗旱性,维持植株较高的光合指标,并降低叶片离体失水能力。在生长上,超表达PtmiR169o拟南芥表现为莲座叶直径和叶面积的增大,超表达PtmiR169o杨树表现为促进植株高度及根系的生长。利用psRNATarget生物信息分析、结合RT-qPCR和烟草共注射及5’RACE实验证明发现PtmiR169o主要作用的靶基因为 PtNF-YA2 和 PtNF-YA6。(3)从毛果杨克隆获得靶基因PtNF-YA6,在干旱胁迫下表达量下调,与PtmiR169o表达模式相反。将PttNF-Y46融合GFP的载体通过烟草表皮注射法观察结果表明杨树PtNF-YA6蛋白定位在细胞核。过表达PtNF-YA6转基因拟南芥可减缓植株生长,降低转基因拟南芥莲座叶面积。同样的,过表达PtNF-YA6降低了转基因杨树高度和叶片的光合效率;在干旱研究上,过表达PtNF-YA6转基因拟南芥的种子萌发和过表达PtNF-YA6转基因杨树幼苗在甘露醇渗透胁迫下均表现为抗性降低;转基因拟南芥成熟苗和转基因杨树移栽苗增加了叶片的离体失水率,从而降低了植株的抗旱性。这与PtmiR169o的功能相反,符合miRNA和靶基因的功能特性。综上,该结果表明PtmiR169o作用于靶基因PtNF-YA6,从而调控植株的干旱胁迫和生长过程。(4)从毛果杨克隆获得PtNF-YA9(非miR169靶基因),PtNF-YA9蛋白定位于细胞核;RT-qPCR结果表明PtNF-YA9在脱水、ABA和盐胁迫下下调表达。PtNF-YA9过表达拟南芥在种子萌发时期,对甘露醇模拟干旱、ABA和盐胁迫下表现出敏感性,且种子萌发后生长停滞。在营养阶段,PtNF-YA9过表达株系通过促进气孔关闭而减少水分流失,表现出较强的耐旱能力。在盐胁迫下,PtNF-Y49过表达株系在含NaCl培养基上主根长度为WT的1.50～1.73倍,在土壤盐胁迫下生长优于WT,表现出较强的耐盐性。此外,PtNF-YA9转基因植株还表现出植株矮化、下胚轴变短、叶面积和生物量减小、开花延迟等特性。过表达PtNF-YA9转基因杨树在甘露醇渗透胁迫和自然干旱条件下,PtNF-YA9转基因杨树也均表现出明显的抗旱性增强;在生长上,过表达PtNF-YA9转基因杨树植株高度显著变矮,节间长度变短;在NAA处理下,NAA显著促进了 WT植株的生长,但对PtNF-YA9转基因杨树作用不显著,表明NAA介导PtNF-YA9对杨树的生长调控过程。综上,不同NF-YA成员在应答非生物逆境过程中存在明显的功能分化,其中PtNF-YA9为抗逆性的正向调节因子;PtNF-YA6为负向调节因子;且PtmiR169o通过靶向PtAF-YA6,正向调节杨树的抗逆性。如何平衡杨树生长与逆境之间的关系,对miRNA169及NF-YA的研究具有重要意义。因此,本研究对杨树miR169及NF-YA家族转录因子的功能研究为林木品种改良提供了一个新的思路并奠定了坚实的基础。