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多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是一种重要的病原体,可以在多种哺乳动物和鸟类中引起严重的疾病。常见疾病包括牛肺炎和牛出血性败血症、猪肺疫和猪萎缩性鼻炎、兔出血性败血症和禽霍乱等。且已有文献报道,多杀性巴氏杆菌也可以感染人引起局部组织损伤,甚至导致全身系统性疾病。这不仅给养殖业带来了巨大的挑战,同时也给人类的生命安全带来了威胁。近年来,随着肉牛养殖的发展,牛多杀性巴氏杆菌病的流行呈现逐渐上升趋势,大多以荚膜A型多杀性巴氏杆菌为主。因此,研究A型多杀性巴氏杆菌的致病机制,无论对于养殖业的生产还是人类的生命健康都极其重要。群体感应（Quorum Sensing,QS）是一种广泛存在于细菌中的交流机制。细菌在生长繁殖过程中产生自诱导剂（autoinducer,AI）,通过简单的扩散方式将自诱导剂分泌到细菌周围环境中,被细菌自身受体识别,当自诱导剂的浓度在环境中达到阈值,就会启动细菌内信号转导过程,从而导致细菌基因表达发生变化,细菌种群行为发生相应变化。主要表现在对细菌营养的摄取、生物发光、生物膜形成、毒力因子的表达等方面的调节。根据诱导分子的不同,群体感应系统可分为4类:AHL介导的群体感应系统、信号肽介导的群体感应系统、AI-2介导的群体感应系统和AI-3介导的群体感应系统。qseC和luxS分别属于AI-3和AI-2介导的QS系统。关于这两个QS系统在多杀性巴氏杆菌中的功能如何,目前国内外尚未有相关的研究报道。本研究中,我们选择多杀性巴氏杆菌PmCQ2株,缺失其群体感应基因qseC和luxS,探讨群体感应基因缺失对多杀性巴氏杆菌毒力的影响,为多杀性巴氏杆菌致病机理研究及弱毒疫苗的开发奠定基础,本研究开展了如下工作:1.PmCQ2-ΔqseC的构建以PmCQ2基因组为模板扩增上、下游同源臂及qseC基因,以p UC19ori KanR为载体构建重组质粒pUC19ori KanR-ΔqseC,通过同源重组的方法成功构建了PmCQ2-ΔqseC。2.PmCQ2-ΔqseC的基本生物学特性通过比较PmCQ2与PmCQ2-ΔqseC的生物学特性,发现二者在生长曲线上没有显著差异;PmCQ2-ΔqseC形成的菌落更小,其荚膜含量显著低于PmCQ2,形成的生物被膜含量显著高于PmCQ2;抗逆性试验显示,与PmCQ2相比,PmCQ2-ΔqseC的高温耐受性和氧化压力耐受性减弱,高渗压力耐受性略增强。3.PmCQ2-ΔqseC的毒力及致病性通过小鼠的半数致死量(LD50)比较了PmCQ2与PmCQ2-ΔqseC的毒力。PmCQ2的LD50为5.79CFU,PmCQ2-ΔqseC的LD50为6.63×10~7CFU,结果显示PmCQ2-ΔqseC毒力远远小于PmCQ2;通过小鼠肺部定殖试验比较了PmCQ2与PmCQ2-ΔqseC的致病性,PmCQ2与PmCQ2-ΔqseC攻毒剂量分别为3.48×10~5CFU和3.20×10~5CFU,在定殖8h、16h和24h的时间内,PmCQ2-ΔqseC在小鼠肺部均基本不定殖,且定殖量远远低于PmCQ2;通过制备并观察定殖24h的小鼠肺部的病理组织切片发现,与PmCQ2相比,PmCQ2-ΔqseC对小鼠的肺部损伤减弱。4.PmCQ2-ΔqseC株对野毒株的免疫保护通过肌肉途径活菌免疫小鼠,进一步评价了PmCQ2-ΔqseC作为弱毒活疫苗的潜力。将PmCQ2-ΔqseC活菌通过肌肉途径免疫小鼠三次后,分别用野生强毒株牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2、牛源B型多杀性巴氏杆菌PmB和禽源多杀性巴氏杆菌PmQ攻毒,记录小鼠的死亡状况。结果显示PmCQ2-ΔqseC对PmCQ2可以完全保护（100%）,对PmB可以部分保护（62.5%）,对PmQ没有保护（0）。5.PmCQ2与PmCQ2-ΔqseC转录组测序结果的分析及验证转录组验证结果显示,转录组测序结果准确。转录组分析结果显示,与PmCQ2相比,在PmCQ2-ΔqseC中,与生物膜形成相关基因大部分上调,与生物膜试验结果一致;毒力相关基因大部分下调,与毒力降低结果一致;应对压力通路相关基因大部分下调,与抗逆性试验结果一致。6.PmCQ2-ΔqseC-ΔluxS的基本生物学特性成功构建了PmCQ2-ΔqseC-ΔluxS基因缺失株。luxS影响了PmCQ2的荚膜与生物膜形成,即与PmCQ2和PmCQ2-ΔqseC相比,PmCQ2-ΔqseC-ΔluxS荚膜生成减少、生物被膜形成增加;luxS影响了PmCQ2的抗逆性,与PmCQ2和PmCQ2-ΔqseC相比,高温耐受性减弱,对氧化压力耐受性的影响为低浓度H2O2表现为减弱、高浓度H2O2表现为增强,渗透压力耐受性减弱且luxS基因与qseC基因起相反作用;luxS影响了PmCQ2的血清敏感性,与PmCQ2相比,抗血清杀伤能力减弱。