脓毒症是ICU（Intensive Care Unit）住院患者首要致死原因，虽然对脓毒症治疗的探索已取得一些进展，但是由于整体免疫调节治疗手段的缺乏，其死亡率仍居高不下。高死亡率主要与脓毒症引起的难控制性的全身炎症反应，并最终发展成多脏器功能衰竭相关。因此，积极开发经济高效的治疗手段及措施，早期切断炎症级联反应关键环节，降低脓毒症死亡率，有着巨大的理论和临床意义。　　近年，我科及国内外同行发现，电针在脓毒症治疗及脑缺血损伤防护方面有可靠疗效，其机制可能与胆碱能抗炎通路的激活密切相关，但是具体机制不清。胆碱能抗炎通路是近10年来对迷走神经功能研究的一项新的成果，自发现以来一直是深入研究的主题。该途径通过与巨噬细胞上α7烟碱型乙酰胆碱受体的相互作用来控制炎症反应，调节机体自主神经系统控制系统免疫，展现出其临床应用于治疗脓毒症类过度免疫炎症反应性疾病方面的巨大潜力。　　因此，本实验旨在探索电针是否通过激活巨噬细胞上α7nAChR介导的胆碱能抗炎通路，从而对脓毒症小鼠发挥器官保护和抗炎以及减小死亡率的作用，为临床ICU患者预防脓毒症的发生提供理论支持,且为开发新的治疗手段提供依据。　　第一部分：电针激活α7nAchR介导的胆碱能抗炎通路在脓毒症小鼠中发挥保护效应的实验研究　　实验一：观察电针对于脓毒症小鼠器官功能和全身炎症反应的影响　　目的：观察电针对于CLP诱导的脓毒症小鼠器官功能和全身炎症反应的影响　　方法：雄性C57BL/6小鼠24只，随机分为4组：假手术Sham组（n=6）、CLP组（n=6）、电针EA+CLP组（n=6）和假电针EA-sham+CLP组（n=6）。其中EA+CLP组于造模前5天开始电针，选择穴位为双侧足三里穴，刺激强度为1mA，2Hz疏密波，每日一次，每次30min，持续5天，假电针组只扎穴位不电刺激。盲肠结扎与穿孔（CLP）24h后取小鼠左肺下叶做病理组织切片，取小鼠右肺叶称其湿重与干重，并计算湿干重比；对小鼠进行支气管肺泡灌洗后BCA蛋白定量法检测灌洗液中蛋白浓度，取小鼠右肝下叶做CD68标记的巨噬细胞和Ly-6G标记的嗜中性粒细胞的免疫组化染色，对小鼠进行腹腔灌洗后用ELISA法检测灌洗液中促炎因子TNF-α和IL-1β的表达水平。　　结果：在CLP24h后，与Sham组相比，小鼠肺组织出现病理损伤，肺湿干重比增大，气管肺泡灌洗蛋白浓度增高（P＜0.05），肝脏巨噬细胞和嗜中性粒细胞浸润明显增加，腹腔灌洗液中TNF-α和IL-1β显著增高（P＜0.05），而电针改善了肺组织病理损伤程度，减小了肺湿干重比值，降低了支气管肺泡灌洗蛋白浓度，减轻了肝脏炎性细胞的浸润和降低了腹腔灌洗液中促炎因子的水平（P＜0.05）。　　结论：电针可以减轻脓毒症小鼠脏器损伤和全身炎症反应。　　实验二：验证电针是否通过激活胆碱能抗炎通路对脓毒症小鼠发挥保护作用　　目的：探索电针是否通过激活胆碱能抗炎通路减轻脓毒症小鼠器官损伤和全身炎症反应。　　方法：雄性C57BL/6小鼠130只，随机分为5组：假手术Sham组（n=26）、CLP组（n=26）、电针EA+CLP组（n=26），α7nAchR抑制剂MLA+EA+CLP组（n=26）和α7nAchR激动剂GTS-21+CLP组（n=26）。盲肠结扎与穿孔（CLP）24h后，每组20只小鼠观察术后7天生存率，其余取材，取材部位以及检测指标同实验一。　　结果：在CLP24h后，与Sham组相比，小鼠生存率明显降低（P＜0.05），肺组织出现病理损伤（P＜0.05），肝脏巨噬细胞和嗜中性粒细胞浸润明显增加，腹腔灌洗液中TNF-α和IL-1β显著增高（P＜0.05），而电针改善了小鼠的各项异常指标。与EA+CLP组相比，MLA逆转了电针对脓毒症小鼠生存率的提高，逆转了肺组织病理损伤的减轻，逆转了电针对脓毒症小鼠肝脏巨噬细胞和嗜中性粒细胞浸润的减轻，阻断了电针对脓毒症小鼠的腹腔灌洗液促炎因子水平的降低，而GTS-21均模拟了电针的各项保护效应（P＜0.05）。　　结论：电针对脓毒症小鼠发挥保护作用可能是通过激活α7nAchR介导的胆碱能抗炎通路实现的。　　实验三：电针激活α7nAchR介导的胆碱能抗炎通路对脓毒症小鼠NF-κB的影响　　目的：研究电针激活α7nAchR介导的胆碱能抗炎通路后对脓毒症小鼠肺脏中NF-κB的影响以及药物激活该通路对LPS诱导的腹腔巨噬细胞中NF-κB的影响。　　方法：　　1.探索电针激活α7nAchR介导的胆碱能抗炎通路后对脓毒症小鼠肺脏中NF-κB的影响：　　雄性C57BL/6小鼠21只，随机分为4组：Sham组（n=6）、CLP组（n=6）、EA+CLP组（n=6），MLA+EA+CLP组（n=3）。其中，MLA腹腔注射30min后进行电针，同样持续5天。CLP24h后取小鼠左肺下叶用Western blot技术检测各分组中小鼠的左肺下叶中NF-κB的表达水平。　　2.药物激活胆碱能抗炎通路对LPS诱导的腹腔巨噬细胞中NF-κB的影响：从雄性C57BL/6小鼠体内提取腹腔巨噬细胞，体外培养于24孔板，随机分为3组：对照组、LPS组、LPS+GTS-21组，各组药物刺激24h后，免疫荧光染色观察NF-κB p65在细胞内的位置。　　结果：　　1.脓毒症小鼠左肺下叶中NF-κB的表达相比于Sham组显著增高（P＜0.05），而.电针明显下调了NF-κB的表达（P＜0.05）。MLA阻断胆碱能抗炎通路后再电针处理，相比于电针组，MLA又部分恢复了脓毒症小鼠肺脏NF-κB的表达水平，表明MLA阻断了电针的保护作用。　　2.与对照组腹腔巨噬细胞相比，LPS组NF-κB p65从细胞质向细胞核转移，而GTS-21干预后反转了这一现象。　　结论：电针激活α7nAchR介导的胆碱能通路可能是通过降低脓毒症小鼠NF-κB的活性发挥作用且α7nAchR激动剂逆转了LPS诱导的腹腔巨噬细胞NF-κB p65的核转位。　　第二部分：药物激活α7nAchR介导的胆碱能抗炎通路在LPS诱导的巨噬细胞中发挥抗炎效应的实验研究　　实验一：LPS对巨噬细胞促炎因子分泌的量效和时程关系的影响　　目的：观察不同浓度和同一浓度LPS对巨噬细胞促炎因子分泌的量效和时程关系的影响。　　方法：　　1.观察LPS对巨噬细胞促炎因子分泌的量效关系RAW264.7细胞，随机分为6组：对照组、1μg/L LPS、10μg/L LPS、100μg/L LPS、500μg/L LPS和1000μg/L LPS组，刺激5h后，ELISA法检测细胞培养上清液TNF-α的水平;　　2.观察LPS对巨噬细胞促炎因子分泌的时程关系RAW264.7细胞，随机分为8组，均接受100ng/ml LPS刺激，时间点包括即刻、2h、4h，8h、12h、24h、48h、72h， ELISA法检测细胞培养上清液TNF-α的水平。　　结果： LPS组TNF-α的表达较对照组升高，且在100ng/ml LPS组TNF-α的表达较对照组升高达高峰（P＜0.001）；24h组在100ng/ml LPS刺激后TNF-α的表达较对照组升高达高峰（P＜0.001）。　　结论： LPS诱导RAW264.7细胞促炎因子TNF-α表达上调，在24h达高峰　　实验二：α7nAchR激动剂激活胆碱能抗炎通路后对巨噬细胞促炎因子分泌的影响　　目的：观察α7nAchR激动剂GTS-21对LPS诱导的巨噬细胞促炎因子TNF-α、IL-1β、HMGB1分泌的影响　　方法：　　1.用免疫荧光法检测α7nAchR这一胆碱能抗炎通路的关键受体是否存在于RAW264.7巨噬细胞膜上；　　2. a.实验分为5组：对照组、1μM GTS-21、10μM GTS-21、100μM GTS-21和1000μM GTS-21组，药物刺激24h后，CCK8法检测细胞活力；b.实验分为5组：对照组，LPS组，LPS+1μM GTS-21、LPS+10μM GTS-21、LPS+100μM GTS-21组，药物刺激24h后，CCK8法检测细胞活力；　　3.实验分为4组：对照组、LPS、LPS+10μM GTS-21、LPS+100μM GTS-21组，药物刺激24h后，ELISA法检测细胞培养上清液TNF-α、IL-1β的水平　　4.实验分为3组，对照组、LPS组、LPS+100μM GTS-21组，药物刺激24h后Western blot检测HMGB1的表达水平，免疫荧光定位HMGB1在细胞内的位置。　　结果：α7nAchR存在于RAW264.7巨噬细胞膜上，α7nAchR激动剂GTS-21无细胞毒性作用且GTS-21剂量依赖性地恢复了LPS诱导的细胞活力下降（P＜0.05），GTS-21剂量依赖性地降低了LPS诱导的促炎因子TNF-α、IL-1β表达水平（P＜0.05），同时降低了LPS诱导的HMGB1的表达水平（P＜0.05）,并反转了LPS诱导的HMGB1胞质转移。　　结论：α7nAchR激动剂剂量依赖性地降低了LPS诱导的巨噬细胞促炎因子TNF-α、IL-1β、HMGB1的分泌水平。　　实验三：α7nAchR激动剂对LPS诱导的巨噬细胞中NF-κB的影响　　目的：观察α7nAchR激动剂对LPS诱导的巨噬细胞中NF-κB状态的影响　　方法： RAW264.7细胞，随机分为3组：对照组、LPS组、LPS+100μM GTS-21组,药物刺激24h后免疫荧光染色观察NF-κB p65在细胞内的位置。　　结果：与对照组相比，LPS组NF-κB p65从细胞质向细胞核转移，而GTS-21组反转了这一现象。　　结论：α7nAchR激动剂逆转了LPS诱导的NF-κB p65的核转位。