胆固醇是哺乳动物细胞膜的重要组成部分，对于维持细胞膜的结构和功能起着关键的作用，其在细胞内物质转运，细胞的分化和胚胎的发育等生理过程中也发挥着重要作用，但细胞内胆固醇水平升高会破坏细胞膜的结构并促进细胞凋亡。此外，血浆胆固醇水平升高会诱发多种疾病，如动脉粥样硬化和冠心病等。研究表明，通过饮食摄入过多的胆固醇是导致高胆固醇血症的主要原因之一，因此，有关胆固醇吸收的研究是目前脂类代谢领域的研究热点。　　SAK-HV蛋白是本实验室前期构建的一种多功能融合蛋白，分子量17KD，其分子结构包含突变的SAK(Staphylokinase，葡激酶)分子、RGD序列以及水蛭素12肽序列，其中SAK分子主要发挥溶解纤维蛋白的作用，RGD序列可以抑制血小板聚集，水蛭素12肽序列则可以抑制凝血酶引起的炎症反应。构建SAK-HV蛋白的最初目的是期望针对溶栓、抗凝和抗炎三方面实现多靶点抗动脉粥样硬化的作用。在药效学研究中我们发现SAK-HV蛋白可以抑制高脂喂养ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的发展和血管内皮细胞的炎性反应，此外我们惊奇地发现其还可以降低高脂喂养ApoE-/-小鼠的血浆胆固醇水平，但是其降胆固醇的机制尚不清楚。　　哺乳动物体内胆固醇的代谢包括胆固醇的吸收、合成以及排泄等。小肠是机体胆固醇吸收的主要场所，表达于小肠上皮细胞刷状缘膜的NPC1L1蛋白是参与小肠胆固醇吸收的重要蛋白，NPC1L1蛋白通过其NH2端的一个富含半胱氨酸的氨基端结构域(N-terminal domain，NTD)结合胆固醇，随后通过囊泡内吞的方式进入细胞内从而介导小肠上皮细胞对胆固醇的吸收。研究表明NPC1L1基因敲除小鼠的小肠胆固醇吸收水平降低了70％，而NPC1L1的抑制剂Ezetimibe可以降低高脂喂养的斑马鱼的血浆胆固醇水平。另外表达于小肠上皮细胞刷状缘膜的ABCG5/ABCG8蛋白则可以将小肠吸收的游离胆固醇逆转运至肠腔随粪便排出，研究表明小鼠ABCG8基因的缺失明显升高了小肠对胆固醇和谷固醇的吸收，而小鼠ABCG5和ABCG8过表达则会降低胆固醇和谷固醇的吸收。肝X受体(Liver X receptor，LXR)是一种配体激活的转录因子，属于核受体超家族，其亚型LXRα(Liver X receptor-a)和LXRβ(Liver X receptor-β)在机体脂质代谢中发挥了重要的调节作用。文献报道Caco-2细胞和小鼠小肠中LXRα和LXRβ表达的上调可以降低NPC1L1的表达并上调ABCG5和ABCG8的表达。肝脏是胆固醇合成的主要场所，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)是胆固醇合成过程中的限速酶，哺乳动物肝脏中的ABCG5/ABCG8蛋白可以促进肝脏胆固醇排泄至胆汁，此外，在人和灵长类动物肝脏中表达的NPC1L1蛋白参与了胆汁中胆固醇的重吸收。　　前期的实验结果提示SAK-HV蛋白可以显著降低高脂喂养的ApoE-/-小鼠的血浆胆固醇水平，但其是否通过抑制小肠胆固醇的吸收起作用，这需要我们进一步的研究证实。因此本研究通过动物实验和体外细胞实验研究了SAK-HV蛋白对小肠胆固醇吸收的影响及可能的机制，由于肝脏在胆固醇代谢中的重要作用，我们同时也关注了其对参与肝脏胆固醇合成和排泄的相关基因表达的影响。主要研究内容和结果分为如下两部分:　　1、动物水平研究SAK-HV蛋白对胆固醇吸收的影响及可能的机制:　　前期的实验证实高脂喂养的ApoE-/-小鼠给予SAK-HV蛋白处理后血浆胆固醇水平降低，因此本研究以ApoE-/-小鼠为实验对像，高脂饲料喂养建立高脂动物模型，同时以野生型C57小鼠为对照组，给予正常饲料喂养，高脂饲料喂养一周后检测血脂水平发现高脂喂养的ApoE-/-小鼠血浆总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)和低密度脂蛋白(LDL)水平明显高于对照组C57小鼠，而高密度脂蛋白(HDL)则无明显变化，表明高脂模型建立成功。随后按体重将高脂喂养的ApoE-/-小鼠随机分为模型组和二个SAK-HV蛋白给药组（0.125mg/kg给药组、0.5mg/kg给药组），每组12只，给药组小鼠尾静脉注射连续给药14天，模型组小鼠给予同等体积的生理盐水，给药结束后检测血脂水平发现SAK-HV蛋白给药组小鼠血浆TC和TG水平相较于模型组明显降低，但给药组两组之间并无明显差异，LDL和HDL则无显著变化，说明SAK-HV蛋白可以降低高脂喂养ApoE-/-小鼠血浆胆固醇水平。随后我们选择0.5mg/kg给药组和模型组ApoE-/-小鼠为研究对象，研究SAK-HV降低高脂喂养ApoE-/-小鼠血浆胆固醇的机制，qPCR和Westernblot分别检测小肠和肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA和蛋白的表达水平，结果发现给药组小鼠小肠NPC1L1的表达降低、而ABCG5/ABCG8和LXRβ的表达水平升高，LXRα的表达则有轻度下调。在肝脏中，ABCG5/ABCG8和LXRα/LXRβ的表达水平两组之间未见差异，但给药组HMGCR的表达水平较模型组表达下调。　　2、细胞水平研究SAK-HV蛋白对胆固醇吸收的影响及可能的机制　　为了进一步验证动物实验的结果，我们以Caco-2细胞作为实验对象，在体外研究SAK-HV蛋白对小肠上皮细胞胆固醇吸收的影响，分别给予不同浓度的SAK-HV蛋白刺激24h后，以NBD-胆固醇作为荧光探针检测Caco-2细胞胆固醇吸收水平，结果发现在50μg/ml浓度时Caco-2细胞胆固醇吸收水平明显降低。利用qPCR和Westernblot检测Caco-2细胞胆固醇吸收相关基因mRNA和蛋白的表达水平发现，NPC1L1的表达在100μg/ml时显著下调，而ABCG5和ABCG8分别在20μg/ml和50μg/ml时表达上调，LXRα mRNA和蛋白的表达水平在20μg/ml浓度时表达上调，但LXRβ仅在100μg/ml时表达上调。随后我们以100μg/ml的SAK-HV蛋白刺激Caco-2细胞不同时间研究不同刺激时间对Caco-2细胞胆固醇吸收和相关基因表达的影响，结果显示当100μg/ml的SAK-HV刺激6h时Caco-2细胞胆固醇的吸收水平显著降低，qPCR和Westernblot的检测结果表明NPC1L1在刺激6h时表达下调，ABCG5/ABCG8的蛋白表达水平在刺激3h时上调，LXRα的表达在刺激12h时表达上调，而LXRβ的表达水平在刺激3h时已经上调。　　由于在动物试验中我们发现SAK-HV给药组的高脂喂养的ApoE-/-小鼠肝脏胆固醇合成限速酶HMGCR的表达降低，为了研究SAK-HV蛋白在体外对肝细胞胆固醇代谢相关基因表达的影响，我们以HepG2细胞为实验对象，以不同浓度SAK-HV蛋白刺激24h，qPCR和Westernblot检测结果显示SAK-HV蛋白对HepG2细胞的NPC1L1、ABCG5/ABCG8、LXRα/β以及HMGCR表达均无影响。　　综上所述我们通过动物实验证实了SAK-HV蛋白可以降低高脂喂养ApoE-/-小鼠的血浆胆固醇水平，并发现小肠NPC1L1蛋白表达下调，而ABCG5/ABCG8和LXRβ的表达上调。我们推测SAK-HV蛋白可能通过激活小肠LXRβ的表达，调节其下游靶基因NPC1L1和ABCG5/ABCG8的表达从而抑制小肠胆固醇的吸收，并最终达到降低血浆胆固醇的效果。通过细胞实验我们进一步证实了SAK-HV蛋白可以抑制Caco-2细胞胆固醇的吸收，并揭示了与动物实验相同的机制。因此我们初步得出结论:SAK-HV蛋白可以抑制小肠胆固醇的吸收，其作用机制可能为，SAK-HV蛋白激活转录因子LXRα/β的表达，进而调节小肠NPC1L1和ABCG5/8的表达，最终抑制了小肠胆固醇的吸收。以上的研究结果为SAK-HV蛋白作用机制的阐明和后续的药物研发打下了坚实的基础。