背景:急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童时期最为常见的恶性肿瘤,其中又以B系(B-ALL)居多。随着诊疗水平的提高及治疗方案的改进,急淋患儿的缓解率和预后明显改善,但仍有20%-30%不能缓解而最终死亡,并且化疗副反应所引起的严重合并症也不容小觑,寻找新的治疗策略迫在眉睫。基因靶向治疗是当前恶性肿瘤治疗的研究热点,而自杀基因靶向疗法是其中最有前途的策略之一。然而由于缺乏将自杀基因传递至肿瘤组织的理想载体,使其发展受到阻碍,因此开发更有效的自杀基因系统及载体,提高靶向性具有重大意义。间充质干细胞(MSCs)具有肿瘤靶向迁移能力,且易被转导入各种基因片段,可作为肿瘤靶向治疗的理想载体。但是当前常规二维(2D)培养存在诸多缺点,可导致MSCs的趋化因子受体表达下降,削弱其迁移和归巢能力。而三维(3D)培养能更好地模拟体内微环境,改善细胞功能,因此研究MSCs的三维培养及其对细胞体内迁移能力的影响具有重大意义。此外,大量白血病细胞的生长必须依赖肿瘤微环境中新生血管的生成,其中VEGF(血管内皮生长因子)在血管新生和白血病细胞的抗凋亡进程中处于关键地位。因此寻找和应用有效抑制肿瘤微环境中VEGF水平和血管形成的策略具有重要意义。miRNAs可引起靶mRNA降解或者阻遏靶mRNA的翻译,有效抑制靶蛋白的表达,因此筛选出可有效抑制MSCs和白血病细胞VEGF产生和血管形成的miRNA分子十分重要。再联合自杀基因系统和MSCs 3D培养技术,实现近距离杀伤和血管饥饿双重战术治疗B-ALL,达到良好的局部靶向治疗效果,同时降低系统用药的严重不良反应,以期为B-ALL的临床治疗提供新的策略和研究基础。目的:1.构建良好的脐带间充质干细胞(UCMSCs)三维培养体系,研究三维培养对细胞体内迁移和归巢能力的影响。2.构建高效低毒的以UCMSCs为载体的自杀基因系统。3.筛选出可有效抑制MSCs促血管形成能力的miRNA分子。4.构建高效低毒的自杀基因和miRNA双修饰的3D UCMSCs治疗B-ALL技术体系,抑制肿瘤生长增殖和血管形成,达到良好的靶向治疗效果。方法:1.脐带间充质干细胞的三维培养及迁移能力研究1.1脐带间充质干细胞的分离培养及流式鉴定:取新鲜健康新生儿脐带,采用组织块贴壁培养法分离培养人UCMSCs,显微镜下观察细胞形态,并行流式细胞术检测细胞表型 CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和CD271的表达情况。1.2构建壳聚糖/β-甘油磷酸钠(β-GP)/胶原蛋白/MSCs-CM(间充质干细胞条件培养基)温敏水凝胶-UCMSCs三维培养体系:分别制备壳聚糖、β-GP和I型胶原蛋白溶液,收集脐带MSCs-CM,将它们以一定比例混合后制成温敏水凝胶并验证其温敏特性。显微镜观察联合CCK-8实验检测UCMSCs在水凝胶中的生长和增殖情况。1.3 构建猪脱细胞真皮基质支架(porcine acellular dermal matrix scaffold,PADM)-UCMSCs三维培养体系:将UCMSCs以一定密度种于PADM上,DAPI染色观察细胞的植入及存活状况。1.4比较二维及PADM-UCMSCs三维培养体系中UCMSCs表面免疫标志的表达情况:流式细胞术检测PADM-UCMSCs三维支架中培养7天和14天的细胞表面标志的表达情况,以常规二维培养的UCMSCs为对照。1.5比较二维及PADM-UCMSCs三维培养体系中UCMSCs重要受体的表达:RT-PCR以及Western blot检测比较常规二维培养和PADM-UCMSCs三维支架中培养3天的UCMSCsCXCR4(C-X-C趋化因子受体4)、TLR(Toll样受体)2、TLR3、TLR4和TLR6的表达情况。1.6比较二维及PADM-UCMSCs三维培养的UCMSCs体内迁移和归巢能力:分别将2D,3D和3D+AMD3100(CXCR4受体的抑制剂)培养组的男性UCMSCs移植至雌性BALB/c小鼠,分别于移植后8、24和48h三个时间点处死小鼠,提取各组小鼠心脏、肺、肝、脾、肾、卵巢和骨髓(BM)的基因组DNA,行PCR检测比较每只小鼠体内其它各组织相对于肺组织的SRY 基因(Sex-determining Region on the Y Chromosome,Y染色体性别决定基因)的相对含量。2.YCD:UPRT(酵母菌来源的胞嘧啶脱氨酶:尿嘧啶磷酸核糖转移酶)和miR195修饰的脐带间充质干细胞对急性B淋巴细胞白血病Nalm-6细胞体外作用研究2.1构建含有自杀基因YCD:UPRT的慢病毒载体:慢病毒载体采用以第三代载体系统为基础的四质粒体系构建而成。首先构建LV5-YCD:UPRT-GFP穿梭转移质粒,并行基因测序验证。然后将其和包装质粒共转染293T细胞,进行病毒的包装、收集和滴度测定。同法制备仅含有报告基因GFP(绿色荧光蛋白)的慢病毒载体作为阴性对照。2.2 YCD:UPRT-GFP稳转脐带间充质干细胞的建立及验证:慢病毒载体转染UCMSCs,荧光显微镜下观察转染效率。嘌呤霉素筛选稳转细胞(YCD:UPRT-GFP-UCMSCs)并行流式细胞术验证。同法筛选稳转的阴性对照GFP-UCMSCs。普通PCR检测未转染的UCMSCs、GFP-UCMSCs和YCD:UPRT-GFP-UCMSCs 细胞 YCD:UPRT 基因的表达情况。2.3研究YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-氟胞嘧啶(5-FC)自杀基因系统的自杀效应:CCK-8 实验分别检测 5-FC 对 UCMSCs 和 YCD:UPRT-GFP-UCMSCs的杀伤效率,同时显微镜下持续观察细胞形态变化情况。2.4研究YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-FC自杀基因系统对Nalm-6细胞的旁观者效应:将UCMSCs、GFP-UCMSCs 和 YCD:UPRT-GFP-UCMSCs 分别与Nalm-6细胞共培养,再根据有无添加 5-FC,分成6组。前药(5-FC350μM)处理7天,行显微镜观察、细胞计数和流式细胞凋亡术检测并评估各组Nalm-6细胞的生长状态和凋亡情况。2.5具有抑制血管形成功能的miRNA的筛选及功能验证:首先RT-PCR检测比较 miRNA26a、miRNA27b、miR195 和 miRNA200b 转染对 UCMSCs VEGFA mRNA水平的抑制情况。挑选出抑制程度最高的miRNA并行Western blot检测验证。然后行HUVEC(人脐静脉内皮细胞)成血管实验检测其对UCMSCs的促血管形成能力的抑制情况,并行Western blot检测其对与UCMSCs共培养的Nalm-6细胞的VEGFA蛋白表达的抑制情况。3.YCD:UPRT和miR195双修饰的3D间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病模型小鼠的体内实验研究3.1急性B淋巴细胞白血病动物模型的建立和评估:裸鼠腹腔注射环磷酰胺溶液0.2mL(10mg/mL)1天后,给予 Nalm-6 细胞(1×107/mL)尾静脉注射0.2mL/只。每日密切观察小鼠行为状态和生存状况,以后肢出现瘫痪为发病标准,待其濒死时,脱颈处死,取肝、脾、肾组织行H&E染色,光镜观察各组织肿瘤细胞浸润情况。骨髓涂片瑞氏染色检测幼稚细胞比例。3.2 YCD:UPRT和miR195双修饰的3D脐带间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病模型小鼠的方法和疗效评估:本实验分为四组,(A)正常对照组;(B)造模组;(C)UCMSCs+5-FC组;(D)YCD:UPRT+miR195双修饰的UCMSCs+5-FC组。造模1周后,分别给予两个疗程的各组相应的3D UCMSCs(1×106细胞/200μL/只)+5-FC(500mg/kg/d)X5天处理。然后从以下方面评估疗效:临床表现、体重变化及生存时间;待有第1只造模裸鼠后肢瘫痪时,各组随机选取5只小鼠,快速脱颈处死。行骨髓涂片瑞氏染色,计数并比较各组裸鼠骨髓幼稚细胞比例;取肝、脾、肾及骨髓行H&E染色、GFP免疫荧光染色、CD31和KI-67免疫组化染色检测和比较各组病理结果。结果:1.脐带间充质干细胞的三维培养及迁移能力研究1.1脐带间充质干细胞的分离培养及流式鉴定:本实验分离培养的细胞具有UCMSCs的典型形态和细胞表型特点。1.2壳聚糖/β-GP/胶原蛋白/MSCs-CM温敏水凝胶-UCMSCs三维培养体系构建成功:上述制备的水凝胶具有温敏特性。显微镜下观察UCMSCs在水凝胶三维结构中几乎完全伸展,黏附、生长良好,CCK-8实验表明UCMSCs在水凝胶中培养1周内的具有良好的增殖活性。1.3 PADM-UCMSCs三维培养体系构建成功:DAPI染色观察UCMSCs在PADM支架内植入和存活良好。1.4比较二维及PADM-UCMSCs三维培养体系中 UCMSCs表面免疫标志的表达情况:PADM支架中3D培养14天,UCMSCs的CD105阳性率持续降低(P<0.05),而CD34和CD271的阳性率在3D培养7天时较2D培养明显升高(P<0.05)。1.5比较二维及PADM-UCMSCs三维培养体系中UCMSCs重要受体的表达:RT-RCR和Western blot结果示在PADM三维支架中培养3天,UCMSCs细胞TLR2、TLR3、TLR4、TLR6及CXCR4的mRNA和蛋白表达水平均较二维培养组细胞明显增高(P<0.05)。1.6比较二维及PADM-UCMSCs三维培养的UCMSCs体内迁移和归巢能力:结果显示在输注8h后,以肺组织为对照,3D组UCMSCs向小鼠心脏、肝脏、脾脏和BM中迁移数量显著大于2D组(P<0.05),但是AMD3100处理的3D细胞向肺以外其它各组织的迁移明显受到抑制,甚至低于2D组(P<0.05)。然而在移植后24h和48h,PCR检测结果示各组小鼠肺组织以外的其它各组织均未能检测到SRY基因。2.YCD:UPRT和miR195修饰的脐带间充质干细胞对急性B淋巴细胞白血病Nalm-6细胞体外作用研究2.1携带自杀基因YCD:UPRT及报告基因GFP的重组慢病毒构建成功:LV5-YCD:UPRT-GFP穿梭转移质粒行基因测序验证YCD:UPRT基因序列正确。携带自杀基因YCD:UPRT及阴性对照GFP的慢病毒载体其病毒滴度均为 1×109TU/mL。2.2成功构建稳定表达YCD:UPRT-GFP的脐带间充质干细胞及验证:荧光显微镜观察示慢病毒转染UCMSCs成功。嘌呤霉素筛选后,流式细胞术验证GFP阳性的YCD:UPRT-GFP-UCMSCs的比例高达95%,表明高纯度的稳转细胞构建成功。同法获得作为阴性对照的GFP-UCMSCs。普通PCR结果示只有YCD:UPRT-GFP-UCMSCs可成功表达YCD:UPRT基因。2.3 YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-FC自杀基因系统具有高效的自杀效应:在本实验选用的浓度范围内,5-FC对UCMSCs本身无明显的细胞毒性,但是对YCD:UPRT-GFP-UCMSCs具有强大的直接杀伤作用,且这种杀伤作用具有时间和剂量依赖性。2.4 YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-FC自杀基因系统具有强大的旁观者效应:共培养结果示只有 YCD:UPRT-GFP-UCMSCs+Nalm-6+5-FC组的 UCMSCs 及Nalm-6细胞形态出现异常,大小不一,最终大量死亡,Nalm-6细胞数目明显少于其他五组(P<0.05),且Nalm-6细胞的早期和晚期凋亡率均明显高于其它五组(P<0.05)。2.5具有抑制血管形成功能的miRNA的筛选及功能验证:RT-PCR示miR195对UCMSCs VEGFA基因的表达具有最强抑制作用,Western blot检测验证了 miR195转染可有效抑制UCMSCs的VEGFA蛋白表达,HUVEC成血管实验检测其可有效抑制UCMSCs的促血管形成能力,并且Western blot检测其可有效抑制与UCMSCs共培养的Nalm-6细胞的VEGFA蛋白表达。3.YCD:UPRT和miR195双修饰的3D间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病模型小鼠的体内实验研究3.1急性B淋巴细胞白血病裸鼠动物模型构建成功:造模(30±3)天后,裸鼠后肢行动迟缓,迅速发展为双后肢瘫痪,病情迅速进展直至死亡,平均存活时间(50±7)d;骨髓涂片可见白血病细胞,幼稚细胞比例大于20%;肝、脾、肾组织都可见肿瘤细胞浸润。3.2 YCD:UPRT和miR195双修饰的3D间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病模型小鼠的疗效评估:YCD:UPRT+miR195双修饰的3D UCMSCs+5-FC治疗B-ALL模型裸鼠具有良好的肿瘤靶向治疗效果,可一定程度降低骨髓幼稚细胞比例,有效抑制肿瘤生长增殖和血管形成,改善小鼠的一般情况,减缓体重的下降趋势,延长生存期。结论:1.本研究成功构建PADM-UCMSCs三维培养体系,发现三维培养可明显增强UCMSCs体内迁移和归巢能力,其中CXCR4发挥重要作用。2.本研究构建的YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-FC自杀基因系统在体外可发挥强大的自杀效应和旁观者效应。3.miR195可有效抑制UCMSCs促血管形成能力。4.YCD:UPRT+miR195 双修饰的 3DUCMSCs+5-FC 治疗 B-ALL 模型裸鼠,可有效抑制肿瘤生长增殖和血管形成,具有良好的靶向治疗效果。