背景和目的慢性乙型病毒性肝炎(CHB)的发生及发展机制与乙肝病毒变异、宿主的免疫状态、宿主性别、年龄、遗传基因和肝脏内炎症活动密切相关。然而,隐匿性HBV感染(OBI)在病毒学特征、合并感染、宿主免疫应答以及表观遗传学等方面尚未阐述清楚,特别是感染宿主的分子与细胞免疫功能少有报道。本研究目的为探讨献血人群的隐匿性HBV感染状态,揭示OBI携带者HBV特异性分子细胞免疫反应特征与OBI发生的作用机制。研究对象2016年8月至2017年12月广州血液中心无偿献血者人群。建立的研究队列包括:OBI 组 37 例,CHB 组 53 例(含 CHB-HBeAg-组 42 例,CHB-HBeAg+组 11例),HBV感染康复组47例,HBV非感染组56例(含疫苗免疫组33例,正常对照组23例),合计193例。方法采用化学发光法对研究队列血浆样品进行乙肝表面抗原(HBsAg)检测,核酸检测法(NAT)检测HBVDNA,qPCR定量检测病毒载量,巢式PCR进行病毒基因扩增并测定其核苷酸序列。采用HBV Core和HBV Pol多肽库特异性刺激物,体外刺激研究人群外周血单个核细胞(PBMCs),采用T细胞增殖试验(CFSE)检测T细胞增殖情况,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测HBV特异性T细胞分泌IFN-γ的频数,细胞内细胞因子染色(ICS)检测 IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数及细胞来源,流式微球试验(CBA)检测PBMCs分泌细胞因子的总体水平。采用SPSS 20.0统计分析软件,正态分布的计量资料采用两独立样本t检验,多组间比较采用One-Way ANOVA分析;非正态资料组间比较采用Mann-Whitney U检验,各组间比较采用Mann-Whitney U检验;相关性检验采用Spearman’s相关分析;P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.OBI献血者人群特征。研究发现HBcAb阳性的献血者人群OBI发生率较高,特别是在单独HBcAb 阳性者更高;OBI发生率随年龄增长而增高,男性高于女性;OBI毒株基因型以B型为主。2.T细胞增殖特征。采用CFSE方法,在非特异性刺激物PHA刺激下,以CD8+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异不显著(P=0.403),但OBI组和CHB组的增殖率低于正常对照组(74.0%,78.1%vs.82.1%);在特异性刺激物HBV Core和Pol多肽库刺激下,以CD4+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异显著(P<0.001),其中OBI组和CHB组的增殖率显著高于正常对照组(3.0%,3.3%vs.1.7%),差异显著(3.0%vs.1.7%,P=0.016;3.3%vs.1.7%,P<0.001)。3.特异性IFN-γ分泌T细胞频数测定。采用ELISPOT检测方法,在PHA刺激下,OBI组和CHB组特异性T细胞的免疫应答高于其他三组,差异显著(P=0.004)。在三种重组蛋白(HBcAg,HBsAg-ayw,HBsAg-adw)和多肽库的刺激下,总体比较六组研究对象特异性T细胞应答强度,结果差异显著(P<0.05)。OBI组(160 SFC/106 PBMCs)对HBcAg重组蛋白刺激的应答强度高于正常对照组(95 SFC/106 PBMCs),低于CHB-HBeAg-组(208 SFC/106 PBMCs)。在HBV Core和Pol多肽库刺激下,OBI组(25 SFC/106 PBMCs)和CHB-HBeAg-组(25 SFC/106 PBMCs)的应答强度均高于正常对照组(5 SFC/106 PBMCs)。比较两种多肽刺激下的总体阳性反应率,HBV Core多肽库显著高于HBV Pol多肽库(44.6%vs.16.1%),HBV Core多肽库刺激下的T细胞ELISPOT阳性反应率以OBI组(64.0%)最高,其次是HBV感染康复组(53.2%),显著高于正常对照组(21.7%)。4.胞内细胞因子T细胞频数及胞外分泌型细胞因子水平测定。ICS检测结果显示,在PMA刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在OBI组和CHB组中均高于正常对照组(P<0.05),而分泌IL-17A和IL-21的T细胞频数在OBI组均低于CHB组(P<0.05)。在HBV Core多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在HBV感染康复组中高于OBI组和正常对照组(P<0.05);而分泌IL-2和IL-10的T细胞频数在OBI组和CHB组中高于正常对照组(P<0.05)。在HBV Pol多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21的CD4+和CD8+T细胞频数在CHB组显著低于其他组(P<0.05),而分泌IL-10和TGF-β的CD4+T细胞频数在OBI组显著低于其他组(P<0.05)。胞外分泌型细胞因子水平CBA检测结果显示,在HBV Core多肽刺激下,IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组(P<0.05);在HBVPol多肽刺激下,IFN-γ、IL-2和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组(P<0.05)。ICS与CBA实验检测细胞内、外因子结果基本一致。5.MDSCs水平测定。根据细胞亚群计数显示,OBI携带者外周血中M-MDSCs水平显著低于CHB患者(P<0.001),而与正常对照组差异不显著(P=0.860);G-MDSCs水平在五组人群中无差别(P=0.914)。OBI携带者和CHB患者外周血中 M-MDSCs 和 G-MDSCs 水平与 ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA、ALB、ADA、CHE、γ-GT和TP等肝功能指标无相关性(P>0.05)。结论OBI携带者和CHB患者均呈现显著高于HBV感染康复者及非感染者的HBV特异性T淋巴细胞增殖反应;OBI携带者与HBV感染康复者及CHB患者均呈现显著的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数增高,以OBI组阳性反应率最高,HBV感染康复组和CHB-HBeAg-组次之,CHB-HBeAg+组最低;HBV感染康复组特异性分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21细胞因子的CD4+和CD8+效应T细胞频数显著增高,而OBI组和CHB组分泌IL-10细胞因子的抑制T细胞频数增高,CHB组效应T细胞频数较低而OBI组分泌IL-2和IL-17A的T细胞频数相对升高;CHB组分泌IL-10细胞因子水平增高,而OBI组分泌IL-17A细胞因子水平相对较高。因此,OBI携带者的HBV特异性T效应细胞反应水平居于HBV感染康复者与CHB患者之间,而CHB患者T抑制细胞反应水平较高,从而导致了三组HBV感染者的不同转归状态。创新之处1.献血者人群通常为未经抗病毒等治疗的健康人群。本论文以HBV感染不同转归状态的献血者为研究对象,排除了抗病毒治疗等干扰;采用新鲜分离的PBMCs进行实验,避免了淋巴细胞由于冻存和复融发生死亡和免疫功能的改变对结果的影响。2.与以往研究选用HBV重叠多肽不同,本研究合成的HBV Core和HBV Pol多肽是经研究证实能刺HBV产生特异性细胞免疫应答的HLA-Ⅰ型和HLA-Ⅱ型限制性多肽,结果更能反应HBV感染后不同转归人群对T淋巴细胞免疫应答状态。3.本研究根据HBV感染献血者不同转归状态,分析了 T细胞亚群分泌的七种特异性细胞因子的频数及分泌型细胞因子的水平,阐明了 OBI携带者、CHB患者及HBV感染康复者的三种转归状态的分子细胞免疫基础。