口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是一种具有高度传染性和极具经济破坏性的病毒性疾病,主要感染牛、羊等反刍动物、猪以及某些野生类偶蹄动物。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)是引发该病的病原体,隶属小RNA病毒科口蹄疫病毒属。虽然针对FMD采取了严格的检疫制度以及疫苗接种等防控措施,但在我国及世界其它地区仍时有发生。研制更加安全有效的FMD新型疫苗具有重要性和紧迫性。VP1是FMDV最重要的结构蛋白和免疫原性蛋白,常被广泛应用于各种新型基因工程疫苗的研究。VP1蛋白通过与病毒自身编码蛋白或宿主细胞蛋白相互作用而在病毒感染和抗宿主免疫等方面发挥多种功能。2B蛋白是FMDV的一个非结构蛋白,具有多种活性,在FMDV感染和释放以及诱导自噬等过程中发挥重要作用。只有彻底了解FMDV蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用关系及其发挥作用的各种机制,才能研制出更加安全有效的疫苗来预防该病。本研究初步研制了牛FMD合成肽疫苗,探索了作为新型疫苗主要候选元件的VP1蛋白与宿主的相互作用,并研究了非结构蛋白2B的宿主互作蛋白及其功能,为深入了解FMDV致病的分子机理以及研制新型疫苗提供了新思路和理论依据。本研究所获得的主要结果如下:1.以FMDV A/HuBWH/CHA/2009流行毒株结构蛋白VP1上129~169位氨基酸、非结构蛋白3A上21~35位氨基酸、3D上346~370位氨基酸为基础表位片段,设计并构建了三组A型FMD合成肽疫苗,分别在豚鼠和牛体内进行了免疫效力评价。结果显示以PB组,即3D(346~370)-PPS-VP1(129~134(T→C)~156(Q→C)~169),免疫动物产生的中和抗体滴度最高,攻毒保护效力最强。用其以50μg/只的剂量免疫豚鼠2次,可100%的抵抗同型病毒的攻击;以100μg/头份的剂量免疫牛1次,可达到60%的保护率。因此PB合成肽,有希望发展成为生产实践中有效的牛FMD合成肽疫苗。本研究为进一步发展和完善FMD合成肽疫苗奠定了一定的基础。2.采集经FMDV感染七天后的长白猪敏感组织,构建了高质量的cDNA表达文库。利用分裂-泛素酵母双杂交系统,以FMDV VP1为诱饵蛋白筛选猪组织cDNA文库,结果发现宿主细胞蛋白zyxin的C末端第329~572位氨基酸能够与FMDV VP1蛋白发生相互作用。利用免疫共沉淀技术以及激光共聚焦技术,进一步验证了FMDV VP1蛋白与宿主细胞蛋白zyxin确实存在相互作用且在细胞中存在共定位。在研究zyxin蛋白对FMDV增殖的作用中发现,BHK-21细胞中zyxin蛋白的表达量随FMDV感染时间上调。之后,利用靶向zyxin基因的特异性干扰小RNA分子沉默细胞内源性zyxin蛋白的表达,经TaqMan荧光定量PCR检测和细胞毒价检测,发现下调zyxin蛋白的表达可抑制FMDV在细胞中的增殖,相反,过表达zyxin蛋白时可促进FMDV的增殖。3.以FMDV 2B为诱饵蛋白筛选猪组织cDNA文库,发现宿主细胞蛋白eEF1G的第208~437位氨基酸能够与FMDV 2B蛋白相结合。通过免疫共沉淀技术以及激光共聚焦技术,进一步证实FMDV 2B蛋白与eEF1G蛋白确实存在相互作用且在细胞中存在共定位。在研究eEF1G蛋白对FMDV增殖的作用中发现,细胞eEF1G表达的上调促进FMDV的增殖,而eEF1G表达的敲低则抑制FMDV的增殖。这一发现与eEF1G的表达量随FMDV感染上调的试验结果一致。