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研究背景:肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发病率位居恶性肿瘤的第5位,死亡率则居第3位。HCC具有恶性程度高、发病隐匿、进展迅速、侵袭性强、复发率高、治疗难度大等特点。虽然近年来HCC的治疗有一定的进展,治疗近期效果和生存期有了一定的进步,但其复发率高,远期疗效不理想,对于晚期HCC目前尚无确定有效、副作用小的治疗方法。因此,为了提高肝癌患者的生存率而加强肝癌分子病理机制的研究,寻找肝癌复发转移的靶基因,探讨肝癌生物治疗的新途径具有十分重要的意义。越来越多的研究显示,基因表达调控在HCC的发病过程中扮演重要的角色。在基因表达调控中,MicroRNA(miRNAs)作为一组内源性非编码,长度为18-25核苷酸的小RNA,其通常与目标mRNA的3′UTR段相结合,从而在转录后水平通过促进其目的mRNA的降解或终止其翻译,进而提供一个快速而敏感的机制来调节基因的表达。miRNAs参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移、细胞周期调节等多种生物学过程。我们前期采用定量PCR比较了正常肝细胞和肝癌细胞中肿瘤相关miRNA表达谱,发现miR-133a在肝癌细胞中低表达。miR-133a在多种恶性肿瘤中起负性调控作用,但其在HCC的发生发展中的作用及其机制如何则未见报道。因此本研究拟从三方面对miR-133a在HCC中的作用进行研究:一、通过分析miR-133a在肝癌组织和正常组织中的表达情况,研究miR-133a与HCC发生、发展的相关性;二、通过分析miR-133a对肝癌细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力以及裸鼠荷瘤模型,研究miR-133a在HCC中的可能功能;三、通过对miR-133a靶基因的预测和鉴定,研究miR-133a在HCC中的可能作用机制。材料与方法:1.通过qRT-PCR技术检测HCC组织与正常组织中miR-133a的表达情况,统计分析HCC组织中miR-133a表达与肿瘤特征之间的关系。2.通过qRT-PCR检测技术检测肝癌细胞株和正常肝细胞株中mi R-133a的表达情况,并利用慢病毒转染的方法获得稳定过表达miR-133a的肝癌细胞Huh7-miR-133a,分别运用MTT、流式细胞术检测mi R-133a对HCC细胞增殖及细胞周期的影响。3.通过细胞划痕实验研究过表达miR-133a对肝癌细胞迁移能力的影响。4.通过Transwell实验研究过表达miR-133a对肝癌细胞侵袭能力的影响。5.裸鼠荷瘤模型研究miR-133a对HCC体内生长的影响。6.生物信息学技术预测miR-133a的靶基因,通过Westernblot验证靶基因,通过荧光素酶报告实验鉴定miR-133a与靶基因的结合位点。7.通过qRT-PCR检测肝癌组织和癌旁组织中靶基因的表达情况,分析靶基因的表达与miR-133a的相关性。结果:1.确定miR-133a在肝癌组织中低表达(0.40±0.17 vs 1.10±0.32,P<0.001),并与肿瘤大小(相关系数-0.25)、血清AFP(相关系数-0.35)呈负相关。2.证实miR-133a在HCC细胞株HepG2和Huh7中的表达均低于正常肝细胞株LO2(1 vs 0.20±0.1,1 vs 0.28±0.09,P<0.001),而高表达mi R-133a的HCC细胞株Huh7的细胞增殖被抑制,细胞周期被阻滞在G1/G0期。3.细胞划痕实验显示过表达miR-133a可抑制Huh7的细胞迁移(划痕距离百分比80±5%vs 50±12%,P<0.05)。4.Transwell实验显示过表达miR-133a对Huh7的细胞侵袭无影响。5.裸鼠荷瘤模型显示接种过表达miR-133a的Huh7细胞肿瘤大小和生长速度显著低于接种对照组细胞者。6.生物信息学技术预测miR-133a的靶基因可能为CDK13,Westernblot验证靶基因为CDK13,进一步用荧光素酶报告实验鉴定靶基因CDK13与miR-133a的结合位点,最后分析了miR-133a与CDK13 mRNA表达的相关性,显示肿瘤组织中CDK13mRNA的表达水平与miR-133a的表达呈负相关。结论:本研究发现在HCC组织中,miR-133a下调表达,且其表达与肿瘤大小、血清AFP呈负相关。研究还证实miR-133a可抑制HCC的增殖,阻滞HCC的细胞周期,抑制其迁移,但对细胞侵袭能力无影响。裸鼠模型实验也进一步证实了miR-133a对HCC生长和增殖的抑制作用。最后采用生物信息学结合生物学实验鉴定miR-133a的靶基因为CDK13,推测miR-133a对HCC增殖和细胞周期的影响可能通过抑制CDK13的表达而发挥作用。