论文部分内容阅读
目的：凋亡抑制因子6（Apoptosis Inhibitor6，Api6）也叫作AIM、Spα或CD5L，是清道夫受体富含半胱氨酸残基家族新成员。近年来Api6在细菌感染、炎症反应、脂质代谢和肿瘤发生中的作用越来越受到人们的关注。本课题拟采用蛋白原核表达的方法，诱导表达人Api6融合蛋白，为进一步研究Api6在脂质代谢和肿瘤发生中的作用奠定基础。 材料与方法： 1.PCR体外扩增人Api6 cDNA全长，产物回收纯化，经T4 DNA连接酶16℃连接构建入原核表达载体ppSUMO，经BamH I-HF/Hind III双酶切电泳鉴定和DNA测序鉴定，获得可以表达Api6基因的重组质粒ppSUMO-Api6。 2.重组质粒ppSUMO-Api6经化学转化法转化原核表达宿主菌E.coli Rosetta感受态细胞，经卡拉抗性筛选、BamH I-HF/Hind III双酶切电泳鉴定和DNA测序鉴定，构建重菌ppSUMO-Api6-Rosetta。 3.采用蛋白原核表达的方法，不同诱导前菌液浓度，不同温度、不同IPTG浓度、不同诱导时间，筛选诱导表达重组蛋白ppSUMO-Api6的最优条件。 4.100μg/ml ox-LDL处理人肺腺癌细胞A54924h致细胞凋亡，同时加入重组蛋白ppSUMO-Api6处理细胞24h，观察细胞凋亡的改变。 结果： 1.成功构建重组质粒ppSUMO-Api6。 2.成功构建重组菌ppSUMO-Api6-Rosetta。 3.诱导重组蛋白ppSUMO-Api6原核表达的最优条件为：OD600=0.5～0.8的重组菌，16℃、0.5mM IPTG诱导ppSUMO-Api6-Rosetta16h。 4.与对照组相比，诱导表达的重组蛋白ppSUMO-Api6可以使ox-LDL所致A549细胞的凋亡下降10%（P＜0.05）。 结论： 含有人Api6 cDNA全长序列的重组质粒ppSUMO-Api6，经转化原核表达宿主菌E.coli Rosetta感受态细胞，在诱导前菌液OD600=0.5～0.8、16℃、0.5mM IPTG、诱导16h这一优化的诱导条件下，重组菌ppSUMO-Api6-Rosetta可诱导重组蛋白ppSUMO-Api6的原核表达。 获得的重组蛋白具有生物学活性，并对A549细胞有凋亡抑制作用。