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研究背景及国内外研究进展 昆虫是世界上种类最多的生物类群，其发育大多数经历蜕皮和变态两种主要的生理过程。昆虫的生长发育主要由蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)控制。在昆虫幼虫阶段JH滴度较高，虫体维持其幼虫状态;在蜕皮变态期JH滴度逐渐降低，而此时20E滴度逐渐升高，最终起始昆虫的蜕皮变态。这两种激素协调控制昆虫的蜕皮与变态过程。研究这一过程的分子调控机制不仅可以为害虫防治提供科学依据，而且可以为研究人类疾病的分子机制提供参考。 先前研究发现蜕皮激素主要是通过核受体ecdysone receptor(EcR)途径转导信号起始昆虫的变态。近些年，随着分子生物学技术水平的日趋提高，研究人员发现了20E激素信号通路存在非基因组途径。许多信号通路中的蛋白质会发生快速的磷酸化修饰及移位现象。20E也可动员细胞内钙离子的释放及内流。与此同时，20E非基因组途径的膜受体也成为研究的热点。目前在许多物种中都发现了G蛋白偶联受体(GPCR)参与动物类固醇激素的非基因组信号通路，但是具体的机制尚不清楚。 钙离子是细胞内的第二信使，调控多种生理过程，包括基因转录、细胞增殖和细胞凋亡等。类固醇激素20E在昆虫变态过程中促进程序性细胞死亡，而保幼激素JH拮抗20E的功能来阻止变态的发生。20E和JH都能诱导细胞内钙离子水平的增加。然而，这两种功能相互拮抗的激素诱导钙离子水平增加的分子机制及生理结果仍不明确。在这项研究中，我们筛选到在鳞翅目昆虫棉铃虫中的ErGPCR-2作为靶标基因，研究GPCR在20E非基因组途径中的功能，以及钙离子作为第二信使在20E调控的细胞凋亡中的分子机制。丰富和完善了20E信号途径及昆虫生长发育的理论知识。同时为害虫防治及人类疾病治疗提供靶标基因和科学依据。 研究结果 1.G蛋白偶联受体2在细胞膜上控制蜕皮激素信号通路 在这项研究中，我们筛选到了鳞翅目昆虫棉铃虫中的一个GPCR，命名为ErGPCR-2，在细胞膜上控制类固醇激素20-羟基蜕皮酮信号通路。ErGPCR-2在棉铃虫的蜕皮和变态时期具有较高的表达。20E通过ErGPCR-2调控棉铃虫表皮细胞系中钙离子水平快速变化、有关蛋白质的磷酸化、相关基因的转录以及虫体的变态发育过程。ErGPCR-2定位于细胞膜上，在20E的诱导条件下，ErGPCR-2会被G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)所磷酸化，磷酸化修饰后的ErGPCR-2被内吞入细胞质中。内吞入细胞质后的ErGPCR-2被蛋白酶所降解，最终脱敏20E信号通路。细胞系干扰ErGPCR-2减少了20E的类似物[3H] ponasterone A([3H]Pon A)进入细胞的量。细胞系过表达ErGPCR-2和干扰GRK2阻止ErGPCR-2的内吞，都会增加[3H]Pon A进入细胞的量。然而，我们没有检测到ErGPCR-2蛋白直接结合于[3H]Pon A。结果表明ErGPCR-2在细胞膜上传导类固醇激素20E信号并且控制20E进入细胞。 2.蜕皮激素促进钙离子动员并引起细胞凋亡 20E通过GPCR诱导细胞内较强的钙离子水平升高，而JH通过受体酪氨酸激酶(RTKs)诱导较小的钙离子水平增加。钙释放激活钙通道1(Orai1)和瞬时受体电位通道(TRPs Channel)，对20E诱导快速钙离子内流是必需的。相对于JH，20E处理细胞会引起钙离子维持在长时间的高水平状态，并且提高了更多的钙通道相关基因的表达，包括Orai1和TRP通道等。20E会激活Caspase3/7和促凋亡基因的表达，而JH不能。JH可以抑制20E诱导的钙内流、Caspase3/7的激活和凋亡相关基因的表达。高水平的钙离子诱导细胞凋亡。这些结果表明，20E和JH通过不同的途径调节细胞内钙并且维持钙离子在不同的稳态水平，因此导致不同的基因表达和细胞生理反应。 研究结论及科学意义 1.ErGPCR-2在细胞膜上控制20E进入细胞 ErGPCR-2定位于细胞膜上控制[3H]PonA进入细胞。ErGPCR-2在细胞膜上调控20E信号通路。这一研究完善了20E非基因组途径的科学知识，建立了基因组途径与非基因组途径的连接，为今后研究20E信号途径提供了全新的理论依据。 2.蜕皮激素促进钙离子动员引起细胞凋亡 20E通过GPCR动员细胞内较强的钙水平升高，而JH通过RTKs动员较弱的钙水平增加。20E处理细胞会引起钙离子在细胞质中维持在长时间的高水平状态，20E上调更多钙通道相关基因的表达。20E诱导Caspase3/7活化水平、促进细胞细胞死亡和上调促凋亡基因的表达，高水平的钙离子诱导细胞凋亡。钙离子作为细胞中重要的第二信使，在细胞增殖凋亡过程中发挥重要的功能。20E通过GPCR途径动员钙离子使其维持高水平的稳态，最终细胞中高水平的钙离子诱导了细胞凋亡。这一研究证实了钙离子在细胞凋亡中的功能，不仅为完善昆虫凋亡的分子机制做出贡献，也为癌症治疗中促进癌细胞凋亡提供科学依据。