论文部分内容阅读
丝氨酸消旋酶(Serine racemase,SR)依赖辅酶磷酸吡哆醛,催化D-丝氨酸消旋转化成L-丝氨酸,但同时还能催化两种氨基酸的脱水反应。目前已有数种植物的SR在大肠杆菌重组表达和定性,此前,本文在大肠杆菌重组表达了C-端含有组氨酸标签的玉米丝氨酸消旋酶(ZmSR),但标签对催化性质和蛋白结晶影响尚不清楚,为此,本文做了进一步研究,获得以下结果:1.本文构建了2个融合表达SR蛋白的载体,表达的蛋白在N端或C端带有组氨酸标签,在N端组氨酸标签和ZmSR之间,含有烟草噬斑病毒蛋白酶(TEV protease,TEVp)作用序列。2.分析了重组蛋白的可溶性表达和纯化。在16℃诱导24小时以及28℃诱导12小时,SDS-PAGE检测到重组蛋白可溶性表达。Ni-NTA纯化了重组ZmSR,电泳显示纯化蛋白为一条带,不同位置组氨酸标签对重组ZmSR产量有影响;利用TEVp切除N端His6标签,获得无标签ZmSR。3.分析添加甘油对促进蛋白水溶性影响。5%甘油可以明显提高重组蛋白的产量和活性。其中C端His6标签的ZmSR的效果尤为显著,蛋白产量增加了约28倍。ZmSR-His6的产量比His6-ZmSR多,可能是因为插入TEVp识别序列的缘故。4.ZmSR的性质分析。将预装柱Superdex 200 Hiload 10/300 GL装到快速蛋白液相层析(fast protein liquid chromatography,FPLC)分析仪上,在280 nm处检测蛋白流出图谱,显示出单峰,根据标准蛋白分子量算得全酶分子量约为82.0 kDa,而SDS-PAGE计算的单体分子量约为36.0 kDa,表明ZmSR为同亚基二体。5.分析ZmSR活性。无标签ZmSR只有D-丝氨酸消旋酶活性稍高于含His6标签ZmSR,含His6标签ZmSR蛋白的其他三种催化反应活性均显著高于无标签ZmSR。不同位置标签的ZmSR在消旋酶和脱水酶活性上有明显差异。His6-ZmSR的D-丝氨酸消旋酶活性和脱水酶活性高于ZmSR-His6的,而L-丝氨酸消旋酶活性和脱水酶活性是ZmSR-His6相对较高。6.还原剂对ZmSR活性影响。随着DTT浓度的增加,无标签ZmSR的L-丝氨酸消旋酶活性增加但是L-丝氨酸脱水酶活性却降低。当DTT浓度超过4 mM时,L-丝氨酸消旋酶活性的刺激作用以及L-丝氨酸脱水酶活性的抑制作用均变得不显著了。在1 mM DTT条件下,ZmSR的L-丝氨酸消旋酶活性比其D-丝氨酸消旋酶活性高,而L-丝氨酸脱水酶活性比其D-丝氨酸脱水酶活性低,并且C端含His6标签的ZmSR四种催化活性均分别略高于无标签ZmSR相对应的活性。7.ZmSR晶体生长,在Hampton Research公司的Crystal Screen 2-HR2-112 98种条件的18号、28号、46号、95号以及Crystal Screen 2-HR2-144 96种条件下的70号都生长出微晶,经过进一步的优化筛选,在98种条件的46号(0.2 M醋酸钙,pH6.5的0.1 M二甲基砷酸钠,18%(w/v)的PEG8000)条件下获得晶体,并收集到一套晶体衍射数据。综上所述,本实验证明标签有助于重组蛋白的可溶性表达和纯化,标签和还原剂对蛋白酶活性有一定影响,标签也有利于晶体的生长,以上结果表明标签筛选重组蛋白是有其优越性的。